X線結晶解析に基づくジオキシゲナーゼの構造生化学的解明

Research Project

Project/Area Number	12780450
Research Category	Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Structural biochemistry
Research Institution	Shiga University of Medical Science
Principal Investigator	田中裕之滋賀医科大学, 医学部, 助手 (10293820)
Project Period (FY)	2000 – 2001
Project Status	Completed (Fiscal Year 2001)
Budget Amount *help	¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000) Fiscal Year 2001: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000) Fiscal Year 2000: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Keywords	カテコール2,3-ジオキシゲナーゼ / 非ヘム鉄 / ニトロフェノール / 酸素添加酵素 / 酸素の定量 / 反応動力学 / 結晶構造 / 電荷移動錯体 / X線結晶解析 / オキシゲナーゼ / 酸素の活性化
Research Abstract	カテコール2,3-ジオキシゲナーゼは、非ヘムFe^<2+>を補因子とする酵素で、その反応機構、特にO_2活性化機構の解明は、臨床面や環境浄化への応用的研究の基礎として重要である。結晶構造が解明されているextradiol型ジオキシゲナーゼの中で、Pseudomonas putida mt-2由来の本酵素は、反応機構解明に最も適している。そこで、今年度もニトロフェノール誘導体を中心に、物理化学的解析と複合体の結晶構造解析とを平行して進め、以下の成果が得られた。 1,o-およびm-ニトロフェノールは活性部位でプロトンを脱離し、Fe^<2+>に二座配位する。一方、p-ニトロフェノールは、逆に、活性部位でプロトン付加される。さらに、前2者は、金属からリガンドへの電荷移動吸収帯と思われる吸収を長波長領域に示す。ES複合体がO_2を活性するが、その際、基質のカテコールはモノアニオンとして鉄に二座配位する。これらの結果は、活性部位のヒスチジンやチロシン残基の役割やpK値をフェノール誘導体との相互作用の解析から解明できることを明らかにした。2,酵素-ニトロフェノール複合体の精密立体構造を決めるため、良質の結晶の獲得を目指したが、現在のところ、リガンドに相当する明瞭な電子密度を得るには至っていない。しかし、ベンズアルデヒド誘導体の中に、o-ニトロフェノールより強く本酵素に結合するものを見つけ、これとの複合体の構造解析を現在検討中である。精密な原子座標に基づいて量子化学計算を行う予定である。3,活性酸素の産生なしに残存酸素を除去できるアスコルビン酸-アスコルビン酸酸化酵素系が、本酵素の低濃度液の安定な長時間保存に適していることを見つけ、詳しい反応動力学実験が容易に行える方法を確立した。同時に、4-クロロカテコールが微量酸素濃度定量に適していることを見だし、nMレベルのO_2濃度定量法を確立した。