| Project/Area Number |
12780461
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Structural biochemistry
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
尾林 栄治 理化学研究所, 生体物理化学研究室, 基礎科学特別研究員 (50321740)
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| Project Period (FY) |
2000 – 2001
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2001)
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| Budget Amount *help |
¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
Fiscal Year 2001: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000)
Fiscal Year 2000: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
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| Keywords | 一酸化窒素 / グアニル酸シクラーゼ / 大腸菌大量発現系 / 蛋白質結晶化 / ヘム結合部位 / cGMP合成部位 / X線結晶構造解析 |
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| Research Abstract |
一酸化窒素(NO)センサー蛋白質グアニル酸シクラーゼ(sGC)は、NO結合により活性化され、GTPからcGMPを合成する。本研究では、本蛋白質の発現系の構築や共鳴ラマン分光法、部位特異的変異体を調製することにより、NOによるsGCの活性化制御機構を明らかにすることを目的としている。さらに、sGCのX線結晶構造解析も目指した。
本年度は昨年度同様、多量のサンプルを要する本蛋白質の結晶化条件の検索を行うために、申請者は本蛋白質の大量発現系の構築を行った。申請者は、すでにNOの結合するsGCのヘム結合部位のみの大腸菌による発現に成功していたが、安定で均一な蛋白質を得ることができなかったために、良質な結晶を得ることができなかった。そこで培養・精製条件をさらに精密に検索したところ、安定な蛋白質を取ることに成功した。現在このサンプルを用いて結晶化条件を検索中である。
また、昨年度成功しなかった本蛋白質の全長であるヘテロ二量体の発現系の構築は、さらなる培養条件の検索のみでなく、可溶性蛋白質をフュージョンさせ、発現後取り去る方法や、大腸菌内にInclusion Bodyとして発現されたペプチド鎖を天然の形に巻き戻すなどの方法も試みたが、いずれの場合にも良い結果は得られなかった。
大腸菌による蛋白質発現系は、酵母やバキュロウイルスを用いるよりも安価で、かつ大量な試料を短時間で発現させることができるが、哺乳類由来の蛋白質の発現には向かないことが多い。今後さらなる大腸菌発現系の技術開発が期待される。
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