ジーンノックアウト法を用いたヒストンデアセチラーゼ-3の機能解析

Research Project

Project/Area Number	12780514
Research Category	Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Molecular biology
Research Institution	宮崎医科大学
Principal Investigator	高見恭成宮崎医科大学, 医学部, 助教授 (80236356)
Project Period (FY)	2000 – 2001
Project Status	Completed (Fiscal Year 2001)
Budget Amount *help	¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000) Fiscal Year 2001: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000) Fiscal Year 2000: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Keywords	ヒストン / アセチル化 / クロマチン構造 / ヒストンデアセチラーゼ / DT40細胞 / ジーンノックアウト法 / 細胞増殖
Research Abstract	クロマチン構造は種々の要因により多様な動態をとり、様々なDNAの機能発現(複製、転写、修復、組換え等)に関与していると考えられる。クロマチンは基本的にはヌクレオソーム鎖の集合であり、このヌクレオソームの構成員であるヒストンのアセチル化等の修飾がヌクレオソーム鎖の凝縮、伸張に密接に関与している。ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)は酵母では5種、ヒトでは10種の遺伝子(HDAC1-10)が見い出され、いずれのHDACもRPD3 familyに共通に保存されたドメインを有している。しかしながら、他の領域の相同性は低く、いくつかのHDACは異なる複合体中に存在することから、各HDACは互いにredundantな則面と機能的に異なる面を持つものと考えられる。申請者は遺伝学的解析が比較的容易なニワトリBリンパ細胞株DT40を用いて、各chHDAC欠失変異株を作成することにより、これらの機能解析を試みている。HDAC1及びHDAC2に関しては、各々単独欠損では細胞の増殖可能であるが、両者のdouble mutantはlethalであること、chHDAC-2がBリンパ球におけるIgM重鎖遺伝子の転写促進とIgMの膜型mRNAから分泌型mRNAへのスイッチングに深く関与していることを示している。本研究では主にchHDAC-3の機能解析を行った。chHDAC-3はchHDAC-1,2と比べて、C-末端側の約50アミノ酸が欠如し、さらに、N-末端およびC-末端側でのホモロジーも低い。細胞増殖に必須である本酵素に関して、tet-inducible conditional homozygous mutantの作成に成功した.本変異株はtet添加後24時間でFLAG-tagged HDAC-3が検出出来なくなり、しばらくは正常に増殖するが、以後、増殖速度が遅くなり、死滅する。増殖にはchHDAC-3のN-末端側およびC-末端側の各々約150個のアミノ酸、核外輸送シグナル(NES)とデアセチラーゼ活性が必須であった。本変異株はHDAC1,2の過剰発現により相補されないことから、HDAC3独自の細胞増殖調節機能を持つことが示された。したがって、高等真核生物の細胞増殖にはHDACsの関与する独立した2種の経路があることが示唆された。