α1(II)プロコラーゲン遺伝子に相同性を持つ1.6kbの新しい遺伝子の同定と解析

Research Project

Project/Area Number	12877225
Research Category	Grant-in-Aid for Exploratory Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Orthopaedic surgery
Research Institution	Kitasato University (2001-2002) Kyushu University (2000)
Principal Investigator	占部憲北里大学, 医学部, 講師 (90284489)
Project Period (FY)	2000 – 2002
Project Status	Completed (Fiscal Year 2002)
Budget Amount *help	¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000) Fiscal Year 2002: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000) Fiscal Year 2001: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000) Fiscal Year 2000: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Keywords	α1(II)procollagen / 軟骨細胞 / 細胞分化 / α1(II) procollagen
Research Abstract	(1)ラツト長幹骨骨折治癒過程において、II型コラーゲン遺伝子は骨折後7日より発現し骨折後10日に量も強<発現する。一方この1.6kb遺伝子は骨折後3,5日に強く発現し、その後その発現は減少する。また甲状腺機能低下症のラットの肋軟骨においてII型コラーゲンの発現は正常ラットと比較し著明に減少するも、1.6kb遺伝子の発現は正常ラットと同等であった。以上より、1.6kb遺伝子の発現はII型コラーゲン遺伝子の発現と異なることが示された。 (2)ラット肋軟骨のcDNA libraryを作製:13週齢ラットの肋軟骨を採取し、約600mgのtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAよりoligo dTを使用しcDNAを産製した。このcDNAをlambda vectorに組み込み、cDNA libraryを作製した。vectorにくみこまれたcDNAの長さは最長2kbであった。 (3)ラットtype II collagen cDNAのsequenceは、5'側の約530bpしか同定されていなかった。そこでまずラットtype II collagenの約5.1kbの完全長cDNA sequenceを同定した。ラットの塩基配列は、ヒト、マウスとそれぞれ89.4%,94.4%の相同性を認めた。Alternative splicingするexon2の塩基配列は、ヒト、マウスと91.2%,98.5%の相同性を認めた。ラット、マウスのexon2はヒトよりも2塩基短かった。 (4)作製したcDNA libraryのスクリーニング:当初α1(II)procollagenのN末端521bpを含むcDNAと、triple helix領域である3.1-3.9kbを含むcDNAの二つのprobeを用いてスクリーニングを行う予定であった。しかし作製されたcDNA libraryに含まれるcDNAの長さは2kb以下であったため、3.1-3.9kbを含むcDNAのみをprobeとして使用しスクリーニングを行った。20個のpositive clonesのsequenceを行ったがいずれもtype II collagen sequenceと同じであった。現在1.6kb遺伝子がalternative splicingにより発現されている可能性を検討している。