Research Project
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
原核生物NaチャネルのX線構造解析を行うために大腸菌にNaチャネルを大量発現させ結晶化を行ったが良好な結晶が得られないため、LCP (Lipidic cubic phase)法による結晶化を試みた。48時間後から結晶が観察されるようになり、徐々に成長しいくため結晶の成長を経時的に観察し、50umの結晶が得られたので大型放射光施設SPring8にてX線構造解析実験を行った。BL32UにてX線を当てたところ、反射は得られたが11Aと解析を行うだけの分解能が得られなかった。より良好な結晶を得るためにadditive screenを行いつつ、sitting drop vapor diffusionのみで行っていた結晶化をhanging drop vapor diffusion法も試みたがこれらの方法では結晶を得ることができなかった。そこでpackingに影響を与えている可能性があるループ部の可動性領域を今までのconstructionから更に取り除き、新たなconstructionを構築した。大腸菌での発現を確認するため条件検討を行い、SDS-PAGEにて発現を碓認した。続いてNaチャネルの溶液中での安定性をF-SEC (fluorescence size-exclusion chromatography)にて確認したところ単峰性のpeakが得られ安定と考えられたため大量発現を行った。以前のconstructionで結晶が得られていた条件で精製を行ったが途中でggregationを起こしたため金属イオン及びBufferの濃度、種類の条件検討を行ない、都度F-SECにてNaチャネルの安定性の確認を行ったが結晶を得ることができなかった。そのため現時点では生物種を変えて、disopredにより可動性領域を予測してconstructionを作成、再度結晶化に向けて条件検討を行っている。上記のように原核生物のNaチャネルの結晶を得て反射を得ることができたことはその構造を解明する上では意義がある進展と思われる。
(抄録なし)
