性的二色性メダカを用いる内分泌撹乱物質の環境リスク評価法の開発

• Project/Area Number: 13027255
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 片岡 洋行 岡山大学, 薬学部, 助教授 (80127555)
• Project Period (FY): 2001
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2001)
• Budget Amount: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000); Fiscal Year 2001: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
• Keywords: 内分泌撹乱物質 / リン酸化蛋白質 / バイオマーカー / メダカ / エストロゲン活性 / 炎光光度検出ガスクロマトグラフィー / ホスホアミノ酸 / ビテロゲニン

Research Abstract

本研究では、内分泌撹乱化学物質のin vivoでの毒性評価法として(1)遺伝的に雌雄で体色が異なる性的二色性メダカを用いて、形態及び体色変化をマーカーとした性転換に基づく内分泌撹乱化学物質のスクリーニング法と(2)雌特有の体内リン酸化蛋白質(ビテロゲニン)中の構成ホスホアミノ酸をバイオマーカーとする内分泌撹乱作用(エストロゲン様活性)の定量評価法を開発し、環境中の有害化学物質の毒性評価に応用することを目的とした。
(1)では、緋色メダカが雄、白メダカが雌となる性的二色性メダカを用いて、孵化後の性分化が生じる時期にメダカを化学物質に曝露させ、形態学的雌雄(鰭の形状から判別)と遺伝的雌雄(色素斑点の有無から判別)を調べ、性転換魚の出現率を検討したが、稚魚が曝露中に死亡するケースが多く、明確な結論は得られなかった。
(2)では、化学物質を含む水溶液中でメダカを一定期間飼育した後、5%トリクロロ酢酸を加えて蛋白質を沈殿回収した、得られた蛋白質を6N塩酸気相中で110℃、2時間加水分解した後、遊離したホスホアミノ酸は、水溶液中から簡単にN-イソプトキシカルボニルメチルエステル誘導体へ変換でき、FPD-GCにより選択的かつ高感度に分析できた。検出限界はGC注入量としてホスホセリン(P-Ser)50pg,ホスホスレオニン(P-Thr)40pgであった。雄の成熟メダカをβ-エストラジオール(E2)に曝露したところ、E2の入っていないコントロールに比べP-SerとP-Thrレベルが顕著に増加した、また、E2濃度(0.5〜10ppb)及び曝露日数(0〜10日)に依存してP-SerとP-Thrレベルは上昇したが、男性ホルモンのテストステロンによる曝露ではほとんどホスホアミノ酸レベルの上昇は認められなかった。さらに、合成エストロゲンであるEE2やDESでも著しいP-SerとP-Thrレベルの上昇が認められ、エストロゲン拮抗剤であるタモキシフェンの同時曝露によりこれらの上昇が抑制されたことから、蛋白質リン酸化レベルがエストロゲン様活性の指標になることが明らかとなった。この手法を用いて様々な環境化学物質の曝露によるエストロゲン様活性を調べたところ、フタル酸ジ-2-エチルヘキシル、ビスフェノールA、ノニルフェノール、PCBでは、5日間の曝露でほとんどエストロゲン様活性は観察されなかったが、60日間の長期曝露によりエストロゲン様活性を検出できることがわかった、これらの結果は、メダカを環境水中に曝露、あるいは環境中に生息する卵生生物のホスホアミノ酸レベルを調べることにより、環境汚染や生態系への影響を把握できることを示しており、内分泌撹乱化学物質の新しい毒性評価法として有効な手法になるものと期待される。