ミトコンドリアのタンパク質輸入装置複合体の構造解析

• Project/Area Number: 13033030
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 阪口 雅郎 九州大学, 大学院・医学研究院, 助教授 (30205736)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 三原 勝芳 九州大学, 大学院・医学研究院, 教授 (40029963)
• Project Period (FY): 2001 – 2002
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2002)
• Budget Amount: ¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000); Fiscal Year 2002: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000); Fiscal Year 2001: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
• Keywords: 小胞体 / ミトコンドリア / トポロジー / 膜透過 / 受容体 / 膜タンパク質 / シグナル配列 / 前駆体 / 膜輸送

Research Abstract

ミトコンドリアには外膜・内膜それぞれにタンパク質膜透過装置すなわち「tom(translocase of outer membrane)-複合体」および「Tim(Translocase of inner membrane)-複合体」が存在する。本研究はミトコンドリアへのタンパク質輸入に関わる各複合体因子の構造を明らかにし、さらに内膜・外膜のタンパク質輸入装置の構造を解明し、ミトコンドリアへのタンパク質輸入というダイナミックな生命現象を原始レベルで解明することを目的とする。本年度は、Tom-複合体のなかで透過チャネルを構成する中心成分であるTom40の解析を中心に進め以下の成果を得た。
(1)大腸菌で発現し、封入体として高度に精製し、変性剤によって可溶化後、Ni-カラムに結合させその後カラム樹脂上で変性剤から界両活性剤に置き換えることによって立体構造を再生できた。(2)リポソームに再構成したTom40はカチオン選択性のチャネル活性を示し、この活性はミトコンドリア標的化プレ配列ペプチドで阻害されることがわかった。(3)電子顕微鏡では、内直径3nmのリング状構造が観察された。(4)マトリクスへ標的化される前駆体タンパク質を特異的に認識・結合することが、抗体を用いた共沈殿の実験や表面プラズモン共鳴の実験で明らかになった。また、この結合は静電的なものであることが判明した。(5)Tom40に結合した前駆体タンパク質はプロテアーゼに耐性となり、リング状構造の内側にまで進入して結合していることが示唆された。(6)Tom40単独および前駆体タンパク質(Su9-DHFR)との複合体の結晶化条件を検討中である。

Research Products

• [Publications] Sato, Y.et al.: "Integration of Shaker-typeK+ channel, KAT1 into the endoplasmic reticulum membrane : Synergistic insertion of voltage sensing segments, S3-S4 and independent insertion of poreforming segments, S5-P-S6"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99. 60-65 (2002)
• [Publications] Sakaguchi, M.: "Autonomous and Heteronomous Positioning of Transmembrane Segments in Multispanning Membrane Protein"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 296. 1-4 (2002)
• [Publications] Kanki, T.et al.: "The tenth membrane region of band 3 is initially exposed to the luminal side of the endoplasmic reticulum and then integrated into a partially folded band 3 intermediate"Biochemistry. 41. 13973-13981 (2002)
• [Publications] Kida, Y. et al.: "Amino acid residues before the hydrophobic region which are critical for mem-brane translocation of the N-terminal domain of synaptotagmin II"FEBS Lett.. 507. 341-345 (2001)
• [Publications] Miyazaki, B. et al.: "NHE6 protein possesses a signal peptide destined for endoplasmic reticulum membrane and localizes in secretory organelles of the cell"J. Biol. Chem.. 276. 49221-49227 (2001)
• [Publications] Hone, C. et al.: "Characterization of the signal that directs the C-tail anchored proteins to the mammalian mitochondrial outer membrane"Mol. Biol. Cell. 13(in press). (2002)