病原菌エリシター応答における新規カルシウム結合タンパク質の機能解析

Research Project

Project/Area Number	13039002
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Allocation Type	Single-year Grants
Review Section	Biological Sciences
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	竹澤大輔北海道大学, 低温科学研究所, 助手 (20281834)
Project Period (FY)	2001 – 2002
Project Status	Completed (Fiscal Year 2002)
Budget Amount *help	¥4,000,000 (Direct Cost: ¥4,000,000) Fiscal Year 2002: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000) Fiscal Year 2001: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Keywords	カルシウム / エリシター / カルシウム結合タンパク質 / PRタンパク質 / 細胞内情報伝達
Research Abstract	本年度はリガンドスクリーニングによるカルモジュリン結合タンパク質遺伝子の単離と解析を行った。標識したカルモジュリンをリガンドとして用い、cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、カルモジュリンと結合するクローンが単離された。シロイヌナズナのCaMBD86と名付けた667アミノ酸からなるタンパク質をコードする遺伝子は、検索の結果、イネにおいて病原菌感染やSAR誘導剤BTHで特異的に誘導されてくる遺伝子との相同性を示した。シロイヌナズナの葉をBTHで処理すると、CaMBP86遺伝子の顕著な誘導がおこることが発現解析の結果明らかとなった。 CaMBP86とカルモジュリンの相互作用について解析するため、大腸菌でCaMBP86の様々な欠失タンパク質をグルタチオンSトランスフェラーゼの融合タンパク質として発現させた。これらリコンビナントタンパク質をPVDF膜状に転写した後、ビオチン化カルモジュリンを用いてその結合能を評価したところ、アミノ酸490-554領域にカルモジュリンが結合することが明らかとなった。また、アミノ酸506-526領域の合成ペプチドIKVKLKNVSWAIASLSLKRPKAP (CMBPep)は、非変性条件下の電気泳動においてカルモジュリンの移動度をカルシウム依存的にシフトさせたことから、この領域がCaMBP86のカルモジュリン結合部位として同定された。植物の異なるカルモジュリンアイソフォームを用いた結合アッセイから、タバコにおいて過剰発現させるとSAR様の応答を引き起こすことが知られているSCaM4と相同性の高いアイソフォームMsCaMLがCMBPePに対して他より高い親和性を持っていることが明らかとなった。