肝細胞三次元培養系から得られたC型肝炎ウイルス粒子の性状解析

• Project/Area Number: 13770156
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Virology
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 相崎 英樹 感染研, 研究員 (00333360)
• Project Period (FY): 2001 – 2002
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2002)
• Budget Amount: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000); Fiscal Year 2002: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2001: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
• Keywords: C型肝炎ウイルス / 3次元培養系 / 肝細胞 / 感染性クローン / 免疫電顕 / ウイルス様粒子

Research Abstract

フラスコにて培養した1x10^9個のFLC4細胞を培地制御槽に播種し、1日当たり無血清または2%血清添加培地50-100mlを用い、温度を37度より徐々に低下させ培養したところ、肝細胞を100日以上の長期に渡り、継代することなしに培養することができ、その間、酸素消費量、グルコース消費量などで示される肝細胞の活動性は保たれていた。
この3次元培養系に感染性クローンRNA 10ugをトランスフェクションしたところ、培養上清中のHCVRNAはトランスフェクション後から徐々に減少し、44,47,51,54日目には10^3copies/ml未満が続いたものの、その後57日目に再び10^4copies/mlまで増加し、100日目まで約10^<3-4>copies/mlと持続した。また、培養上清中のコア蛋白も徐々に増加した。この培養液中のウイルス粒子の存在様式を調べるために、トランスフェクション後100日目前後の培養液を超遠心法で濃縮し、電子顕微鏡で観察したところ、様々なサイズのウイルス様粒子が認められた。この濃縮培養上清について抗HCVE1抗体を用いた金コロイド免疫電顕間接法を施行したところ、特異的に反応する50-60nmのウイルス様粒子を認めた。
そこで濃縮培養上清をショ糖密度勾配法にて分画したところ、コア蛋白の多い分画の密度は約1.07および1.18g/mlで2峰性になり、HCV RNAの多い分画は約1.07g/mlであった。このことから培養液中に2種類のウイルス粒子の存在が示唆された。平成14年度はそれぞれの分画について抗core, E1,E2抗体を用いた金コロイド免疫電顕間接法を施行し、より詳細な粒子の性状解析を行う予定である。

Research Products

• [Publications] Matsuura, Y., Tani, H., Suzuki, K., Kimura-Someya, T., Suzuki, R., Aizaki, H., Ishii, K., Moriishi, K., Robison, C.S., Whitt, M.A., Miyamura, T.: "Characterization of pseudotype VSV possessing HCV envelope proteins"Virology. 286. 263-273 (2001)