| Project/Area Number |
13770454
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
|
| Allocation Type | Single-year Grants |
|---|
| Research Field |
Dermatology
|
|---|
| Research Institution | Ehime University |
|---|
Principal Investigator |
緑川 和重 愛媛大, 医学部, 助手 (20291502)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2001 – 2002
|
| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2002)
|
| Budget Amount *help |
¥2,900,000 (Direct Cost: ¥2,900,000)
Fiscal Year 2002: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
Fiscal Year 2001: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
|
|---|
| Keywords | P13Kinase / 角化細胞 / 分化 / アポトーシス / サスペンションカルチャー / アデノウィルスベクター |
|---|
| Research Abstract |
A) アウィルスベクターの調整
PI3Kの活性型(AxCA Myr-p110)、阻害型(AxCAΔp85)、Aktの活性型(AxCAMyr-Akt)、阻害型(AxCAAkt-AA)、遺伝子組み込みアデノウィルスベクターを293細胞にて大量に増殖させた後、精製・濃縮・透析を行い-80℃にて保存した。
B) PI3K-Akt経路の阻害による角化細胞の分化誘導
AxCAΔp85を培養角化細胞に感染させPI3K活性を阻害すると、分化と考えられる形態変化を示した。また、AxCAΔp85及び、PI3K阻害剤であるLY294002を加えて、PI3K活性を阻害し、分化マーカーの発現をmulti-probe ribonuclease protection assay(RPA)法にて調べたところ、早期分化マーカーであるK1,K10が誘導されており、形態変化とあわせてPI13K活性を阻害すると分化を誘導することが確認できた。
C) サスペンションカルチャーによる分化誘導
Poly-HEMAでコーティングしたカルチャーディッシュを用いて角化細胞をサスペンションカルチャーし、分化マーカーの発現を検討した。Involucrinタンパクの発現はWestern blot法にて検討し、増加しているとをが明らかとなった。また、K1,K10,inbolucrin, loricrin, transglutaminase-1のmRNA発現はRPA法で解析し、増加を確認した。以上より、Poly-HEMAを用いたサスペンションカルチャーで分化を誘導することが確認できた。
D) Aktの活性化の解析
抗Thr308リン酸化特異的抗体、及び抗Ser473リン酸化特異抗体を用いてWestern blot法にてAktの活性化状態を確認したところ、AxCAMyr-p110でAktが活性化されることが分かった。
|
