ポリシスチン1に対するモノクローナル抗体の作製とGFP蛋白との共発現による検討

• Project/Area Number: 13770610
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Kidney internal medicine
• Research Institution: Tokyo Women's Medical University
• Principal Investigator: 田中 裕子 東京女子医科大学, 医学部, 助手 (10328487)
• Project Period (FY): 2001 – 2002
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2002)
• Budget Amount: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000); Fiscal Year 2002: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2001: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: ADPKD / モノクローナル抗体 / ノックアウトマウス / のう胞腎 / 免疫染色

Research Abstract

本研究の目的は、ADPKDの原因研究において不可欠であると考えられる蛋白の機能解析のため、特異的な抗体を作製し、あわせて最近の蛋白発現の解析系を並行して行うことにある。平成12年度にグルタチオンS-トランスフェラーゼ(以下GST)融合蛋白を抗原としたポリシスチン1に対するモノクローナル抗体をラットリンパ節法を用いて作製した。本法の原理は、抗原エマルジョンをラット後下肢に注射すると腸骨リンパ節が腫大する。このリンパ節内には細胞融合に適した感作B細胞が存在しており、このリンパ節を細胞融合に用いることにより目的のモノクローナル抗体を産生する融合細胞を高率に得ることができる。
ELISAで候補クローンを選定し11個の細胞を保持した。各クローン化した細胞の上清を用いて凍結切片でさらにスクリーニングを行った。組織特異性をマウスの胎生期から、生後4週までの腎、肝で凍結切片を用いて蛍光抗体染色を施行した。サブクローニングを行った抗体株の3つで陽性所見が得られたため培養細胞を増やして抗体量を得ている。さらに同抗体を用いてウエスタンブロッティングを施行。PKD遺伝子産物としての蛋白サイズに等しいバンドを確認した。バンドを切り出しアミノ酸解析を行い確認をする予定である。
最終的には、PKD1のノックアウトマウスで組織染色および腎抽出の蛋白を用いてウェスタンブロッティングを施行して抗体のcharacterizationを行う。