大腸癌に特徴的な細胞内蛋白分解システムの構成成分と標的蛋白の精製と同定

• Project/Area Number: 13770714
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Digestive surgery
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 薄葉 輝之 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (10317935)
• Project Period (FY): 2001 – 2002
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2002)
• Budget Amount: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000); Fiscal Year 2002: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2001: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: ユビキチン / 大腸癌 / ユビキチン-蛋白質結合体 / 蛋白分解システム / ユビキチンー蛋白質結合体 / 細胞内蛋白分解システム

Research Abstract

大腸癌に特徴的な細胞内蛋白分解システムの構成成分と標的蛋白の精製と同定の研究を行い、以下の成果を認めた。
1 免疫沈降法による精製対象蛋白質の選定
大腸癌手術によって得た癌部と非癌部の冷凍保存組織をトリス緩衝液で、それぞれホモジネートしその超遠心上清を水溶性画分とした。一方、不溶性の沈殿物は8M尿素で抽出し難溶性画分の試料とした。高親和性抗ユビキチンモノクローナル抗体FK2を用い、各試料中のユビキチン蛋白結合体を沈殿させた。これをSDS-PAGEで展開後、銀染色及びWestern blotting(抗ユビキチン抗体5F9使用)によって分析した。癌で多く発現するユビキチン化蛋白質のバンドが数種類見出されたが、まずその中の38kDa成分を選択した。
2 ユビキチン-蛋白質結合体の精製、同定
アフィニティークロマトグラフィーに用いる担体は、FK2抗体とNHS-Sepharoseを重合させて調整した。38kDaのユビキチン化蛋白質はイムノアフィニティーカラムクロマトグラフィーとSDS-PAGEで単離し、その内部アミノ酸配列をエドマン分解法で決定した。得られた結果をもとにSwiss-Plot等のデータベースを検索し、該当する蛋白質を同定した。その結果、この38kDaのユビキチン化蛋白質は、ユビキチンとB型ホスホグリセリン酸ムターゼ(PGAM)の複合体と同定された。PGAMは糖代謝酵素であり癌での活性上昇が指摘されているが、ユビキチンシステムとの関連は不明である。現在腫瘍マーカーとしての有用性や生物学的意義について検討を行なっている。