| Project/Area Number |
13771059
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Pediatric surgery
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
藤野 明浩 慶應大, 医学部, 助手 (50306726)
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| Project Period (FY) |
2001 – 2002
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2002)
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| Budget Amount *help |
¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000)
Fiscal Year 2002: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
Fiscal Year 2001: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | 肺 / 先天性横隔膜ヘルニア / 低形成肺 / ナイトロフェン / SDラット / 成長因子 / RT-PCR / 器官培養 |
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| Research Abstract |
本研究ではラット胎仔の低形成肺モデルを用いて正常肺と各種遺伝子の発現を比較しCDHにおける低形成肺の病態及び発生機序の一端を解明することを目的として行っているが、本年度は主に予備実験に重点を置き、RT-PCR法、whole mount ISH法と肺器官培養を行ってその手法を検討した。
1、妊娠9.5日のSDラットにナイトロフェン100mgを経口投与する方法にて低形成肺胎仔を得た。また胎生13〜20日の各日の正常肺とモデル低形成肺を摘出し検討した。
2、胎仔及び実体顕微鏡下に摘出した胎仔肺を直ちに凍結保存する。13-14日肺は非常に小さく、一度に15体分の肺を集めても抽出出来るmRNAは0.1μgにもはるかに満たず抽出に難渋したが、凍結していた肺より効率良くRNAを抽出する方法を検討し、検体処理法とmRNA抽出キットを決定した。
3、続いて、RT-PCR法を用いて次の各成長因子の発現量を比較検討した。KGF、KGF-R、FGF-10、BMP-4、Shh、TGF-β、HGFとそのレセプター等。各種プライマーの特性を掴むためアニーリング温度から伸長反応時間まで様々な予備実験をおこなった。肺に関しては現在のところ良好な条件での結果が得られていない。全身の検索ではナイトロフェン投与胎仔では13日にはKGFの発現がまだ認められないという結果が得られた。また13、14日ではBmp4の発現に差を認めなかった。
4、whole mount ISH法をβアクチンとKGFについて施行した。ラット胎仔胎生12、13日にて外観上は肺でのKGF発現は明らかでなく、以後は胎仔のサイズの問題で良好な結果が得られていない。
5、肺の培養はほぼ100%で成長が認められるような手法を確立した。基質としてマトリゲルを使用する方法を採択した。
本年度の予備実験をもとに来年度は一気に結果を出していく予定である。
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