D周期欠損変異型リコンビナントコラーゲンの人工臓器材料への基礎的研究

• Project/Area Number: 13771213
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Surgical dentistry
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 服部 宇 名古屋大学, 医学部附属病院, 助手 (60332699)
• Project Period (FY): 2001 – 2002
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2002)
• Budget Amount: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000); Fiscal Year 2002: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2001: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: プロコラーゲン / cDNAカセット / リコンビナント蛋白 / コラーゲン / 担体 / 温度安定性 / cDNA カセット / リコンビナント

Research Abstract

本年度は,昨年度に作製された遺伝子cDNAカセット、1.N-protelo-D1-D2-D3-D4-D0.4-C-protelo(Full length type I procollagen 以下 Full lengthと略す)、2.N-protelo-D2-D3-D4-D0.4-C-protelo(以下-D1)、3.N-protelo-n1-D3-D4-D0.4-C-protelo(以下-D2)、4.N-protelo-D1-D2-D4-D0.4-C-protelo(以下-D3)、5.N-protelo-D1-D2-D3-D0.4-C-protelo(以下-D4)、6.N-protelo-D1-D2-D3-P4-C-protelo(以下-D0.4)(protelo : propeptidetelopeptide)をtransfection vector(pcDNA3.1(+))に挿入し、リン酸カルシウム法にて哺乳動物細胞(HT-1080)に遺伝子導入,リコンビナント蛋白の抽出,精製を行った。リコンビナント蛋白はそれぞれT175cm^220個にて大量培養を行い、Western Blotting、Northern Blottingにてそれぞれの蛋白を確認した。Full length、-D1以外は蛋白の安定性、温度安定性が得られず、人工臓器材料としての安定性、利用性は認められなかった。安定な蛋白として得られたFull length、-D1については35℃から42℃の温度安定性では問題なく、生体内での蛋白としての安定性に問題のないことが示唆された。また、ATP incubationを行い、SLSを作製し、遣伝子配列、欠損の状態に対応したアミノ酸配列、三重らせん形成を視認することが可能となり、他の蛋白への応用への道を開いた。Full length、-D1の蛋白を培養フラスコにコーティングし、線維芽細胞、軟骨細胞を培養した。コントロールとして牛由来type Icollagen coatingフラスコを用いた。コントロールと比較し、Full lengthと-D1では細胞の増殖、形態に遜色は認められなかった。また、リコンビナントヒトBMPをFull lengthと-D1蛋自を担体として、マウス大腿筋膜下へ移植した。担体のコントロールとして牛由来アテロコラーゲンを用いた。コントロール、両者ともに骨形成が確認され、骨形成量に差は認められなかったが、組織学的検討により、炎症反応は-D1蛋白を担体として用いたものが一番少なかった。これは担体としての吸収、Drug deliveryシステムとしての有用性が示唆された。以上より、D周期欠損変異型リコンビナントコラーゲンの中で-D1蛋白は人工臓器材料としての温度安定性、生化学的安定性に問題なく、また易吸収性、炎症反応の少ない担体としての有用性が示唆された。