| Project/Area Number | 13771387 |
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Biological pharmacy
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| Research Institution | Showa University |
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Principal Investigator |
藤田 吉明 昭和大学, 薬学部, 助手 (20286868)
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| Project Period (FY) |
2001 – 2002
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| Project Status |
Completed(Fiscal Year 2002)
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| Budget Amount *help |
¥800,000 (Direct Cost : ¥800,000)
Fiscal Year 2002 : ¥800,000 (Direct Cost : ¥800,000)
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| Keywords | シトクロームP450 / 脂肪酸 / 脂質代謝 / 4ファミリー / 組み換えタンパク質 / ラウリン酸 / アラキドン酸 |
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| Research Abstract |
シトクロームP450(CYP)は多様な分子種の存在が示されており、それぞれの分子種は、生体内物質の生合成と代謝、外来性異物の代謝など多岐にわたる反応に関与している。中でも、4ファミリーに属する分子種は主にロイコトリエン、プロスタグランジン、脂肪酸などの内在性基質の代謝を行なうことが知られ、近年その代謝産物が生体に様々な影響を及ぼすことが明らかとなっている。前年度は、ESTデータベースの情報をもとに4ファミリーに属するマウス新規CYP分子種1種(CYP4V3)のクローニングを行い、その構造ならびにその発現場所について明らかにした。CYP4V3は既知の分子種と比較した場合、その相同性は30%前後と比較的低く、この分子種の代謝基質ならびにその産物に興味がもたれた。そこで、酵母用発現ベクターのpAAH5にCyp4v3の翻訳領域を組み込み、酵母内での発現を試みたが、その産生量は比含量26.2pmol/mg poteinと低く、活性測定のためにはより高効率に発現する実験系が必要であると考えられた。そこで、本年度ではより大量の組み換え蛋白質が得られることを期待して大腸菌内での発現を試みた。大腸菌発現用ベクターとしてpTrc99Aを用い、発現効率ならびに発現蛋白質の検出のために翻訳領域の両アミノ酸末端を改変させた。すなわち、N末端側の8個のアミノ酸をウシCYP17の配列と置換し、またC末端側には4個のヒスチジンタグを付加を行った。宿主としてXL1-Blueを用いて発現を行ったが、SDS-PAGEおよび抗ヒスチジン抗体を用いたウエスタンブロットの結果から、期待した大きさの蛋白質の産生を認めることができなかった。発現ベクターを導入した大腸菌に発現誘導剤を処理すると、その増殖が著しく低下することが観察され、この分子種を大腸菌内で発現させるには不適であるように思われた。CYP4V3の代謝基質ならびにその産物については依然として不明であり、動物細胞系を用いるなど、より大量に組み換え蛋白質の産生を行なえる実験系を開発する必要がある。
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