YSST法による網膜再生過程の幹細胞に発現する細胞表面或いは分泌タンパク質の同定

• Project/Area Number: 13877294
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Ophthalmology
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 広中 克典 理化学研究所, 発生神経生物研究チーム, 研究員 (60333308)
• Project Period (FY): 2001 – 2002
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2002)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 2002: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2001: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: イモリ / シグナル配列トラップ / 網膜再生 / オリゴキャッピング法 / 酵母シグナル配列トラップ法 / 細胞膜タンパク / 分泌タンパク

Research Abstract

本研究では、イモリ網膜の再生過程で出現する幹細胞で発現する細胞膜タンパク或いは分泌タンパクを同定することを目的として以下の研究を実施した。
イモリの神経網膜再生過程において虚血による変性後16日目のステージでは、活発な網膜色素上皮細胞の分裂と脱色素化現象が確認され、多数の幹細胞が誕生している。従って本研究では、まず(1)一度イモリの眼球を摘出し再度同じ場所に再移植する手術を行い術後16日目の眼球数百個を集めmRNAを抽出した。(2)東京大学医科学研究所癌ゲノム構造解析分野の菅野純夫先生、鈴木穣先生との共同研究で真核生物の5'末端に存在するキャップ構造を特異的にラベルするオリゴキャッピング法を用いてcDNAを濃縮した。一方、(3)ライブラリー作製の際、uni-directionalにcDNA断片を導入するために、韓国Kwangju研究所Park OK, Park WJ先生から頂いた酵母シグナル配列トラップ(YSST)法スクリーニングベクターpSMASHを改変したpSMASH-DraIIIを作製し、得られたcDNA断片を導入し、増幅した。(4)こうして得られたライブラリーを酵母細胞株DBYα2445(invertase negative strain)に酢酸リチウム法を用いて導入し、シュークロース存在下で生育可能な酵母クローンを選択した。これらのクローンから導入されたcDNA発現プラスミドを回収し、細胞膜あるいは分泌タンパク質が持つシグナル配列を含む遺伝子断片であるかどうかをデータベースから解析し、数個の候補遺伝子断片を得た。今後、これらの遺伝子について全長をクローニング留するとともに、その影響について検討していく予定である。