| Project/Area Number |
13877379
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
医薬分子機能学
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
後藤 順一 東北大学, 医学部附属病院, 教授 (80006337)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
眞野 成康 東北大学, 大学院・薬学研究科, 講師 (50323035)
小林 典裕 神戸薬科大学, 教授 (90205477)
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| Project Period (FY) |
2001 – 2002
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2002)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 2002: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000)
Fiscal Year 2001: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
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| Keywords | プロテオミクス / ファーマコプロテオミクス / ゲノム創薬 / 質量分析法 / ペルオキシレドキシン / アシルアデニレート / イムノアフィニティー抽出 / アフィニティーラベル化 / 胆汁酸 / デオキシコール酸 / ディファレンシャルディスプレー |
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| Research Abstract |
本格的なポストゲノム時代が到来し、世界の各製薬企業はゲノム情報を活用する新規医薬品開発の方向性を模索している。こうした中、薬物や生理活性物質刺激が誘起する変化を分子レベルで捕らえ、標的蛋白質の機能を解析することにより、新たな創薬標的分子を探索するファーマコプロテオミクス手法の確立に多大な期待が寄せられている。本年度は、リン酸による翻訳後修飾蛋白質解析法を検討するとともに、アフィニティーラベル化法とイムノアフィニティー抽出法を駆使した低分子-蛋白質相互作用解析法の構築を試みた。
前年度の結果から、デオキシコール酸刺激によるペルオキシレドキシンIの変動には、リン酸による翻訳後修飾が関与している可能性が示唆された。そこで、2次元ゲル電気泳動マップのディファレンシャルディスプレイを用いるリン酸化蛋白質特定法につき検討した。試料をあらかじめアルカリホスファターゼにより脱リン酸化反応に付した後、2次元ゲル電気泳動法により蛋白質を分離し、マップ化した。次いで、脱リン酸化処理を行わない試料と比較したところ、容易にリン酸化蛋白質を特定できることが判明した。しかも、分離した蛋白質スポットをゲル内にてアルカリホスファターゼ反応に付した後、負イオン検出MALDI-TOFMSにて測定することにより、リン酸化ペプチドを高感度に検出できることが判明した。加えてエキソペプチダーゼを用いるペプチドラダーシークエンス法を用いることにより、そのリン酸化部位の特定も可能であることが明らかとなった。一方、低分子-蛋白質相互作用解析を目的としてアシルアデニレートをアフィニティーラベル化剤として用い、その有用性を吟味したところ、相互作用部位に選択的なラペル化が可能であることが判明した。しかもイムノアフィニティー抽出法を駆使して酵素消化により得たラベル化ペプチドを選択的に抽出し、ラベル化部位の構造解析も可能であることを実証した。
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