部位特異的変異導入によるＭＭＬＶ逆転写酵素の耐熱性と逆転写の正確性の向上
| Project/Area Number |
13J01955
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Research Field |
Applied biochemistry
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
小西 篤 京都大学, 農学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2014)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 2014: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2013: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | 鋳型プライマー / 逆転写の正確性 / 逆転写反応 / 耐熱性 / 部位特異的変異導入 / MMLV逆転写酵素 / M旺V逆転写酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
耐熱型モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（MMLV RT）の耐熱化機構を明らかにするため、野生型MMLV RT（WT）および耐熱型MMLV RTであるE286R、E302K、L435R、D524A、MM4のUV、蛍光、およびCDスペクトルを比較した。耐熱型のスペクトルはWTと同様の形状であり、いずれの耐熱化変異もRTのTrp残基、Tyr残基近傍の環境および分子全体の二次構造に大きな影響を与えないことがわかった。続いて、基質である鋳型プライマー（T/P）と各RTの親和力を評価した。T/P-RT複合体の解離定数は同程度であり、耐熱化変異はRTのT/Pに対する親和力に影響を与えないことがわかった。さらに、RNase H活性を評価した。WTでは反応開始15秒後にRNAが分解されたが、耐熱型では反応開始40分後においても分解されなかった。RNase H活性の活性部位に変異を導入したD524AとMM4とは異なり、E286R、E302K、L435RはRNase H活性部位から離れた部位に変異が導入されているにもかかわらず、RNase H活性を消失した。E286R、E302K、L435Rの耐熱化は、D524AやMM4 と同様にRNase H活性の消失に起因すると考えられた。
核酸系阻害剤（NRTI）耐性変異に相当する変異、Q84D、V223I、N249Wを導入することで、逆転写の正確性の向上を試みた。四種のdNTPのうち三種のdNTP存在下でプライマー伸長反応を行ったところ、Q84D、V223I、N249Wによる生成物は野生型酵素による生成物より短かった。NRTI耐性変異に相当する変異、Q84D、V223I、N249WによりMMLV RTの逆転写の正確性が向上することが示唆された。
逆転写の正確性をより正確に評価する実験系を学ぶため、Dr. Menendez-Arias（Centro de Biologia Molecular “Severo Ochoa”, Madrid, Spain）のもとで指導を受けた（1月12日-2月12日）。帰国後、ブルーホワイトセレクション法を用いたRTの性能測定法のための実験環境を整え、実験系を立ち上げた。現在、本研究は他の研究者により継続されている。
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| Research Progress Status |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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Report
(2 results)
Research Products
(5 results)
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[Journal Article] Amino acid substitutions away from the RNase H catalytic site increase the thermal stability of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase through RNase H inactivation2014
Author(s)
Konishi, A., Hisayoshi, T., Yokokawa, K., Barrioluengo, V., Menendez-Arias, L., Yasukawa, K.
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Journal Title
Biochem. Biophys. Res. Commun.
Volume: 454
Issue: 2
Pages: 269-274
DOI
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Peer Reviewed
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