分泌型タンパク質の翻訳後修飾の解析とｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの同定

• Project/Area Number: 13J04256
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Molecular biology
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 丹羽 祐貴 慶應義塾大学, 理工学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000); Fiscal Year 2014: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2013: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
• Keywords: C-mannosylation / hyaluronidase1 / 糖鎖修飾 / 質量分析 / R-spondin1

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、C-mannosylationされる新たな候補タンパク質としてhyaluronidase1 (HYAL1)に着目し、C-mannosylationされているか否かの解析、及びその機能に与える影響を解析した。HYAL1は細胞外マトリクスのヒアルロン酸を分解することで細胞の運動性を向上させることから、HYAL1の過剰発現は癌の悪性化に関与している。
HYAL1にはTrp130及びTrp321の2カ所のC-mannosylation予測部位がある。そこでHYAL1の過剰発現細胞を樹立し、その培養上清及び細胞抽出液よりHYAL1を精製した。それらを質量分析により解析した結果、培養上清より精製したHYAL1はC-mannosylationされていなかったが、細胞抽出液より精製したHYAL1はTrp130においてC-mannosylationされていることを明らかにした。以上の結果から、HYAL1はC-mannosylationされることで分泌が抑制されていることが示唆された。
次に、HYAL1がヒアルロン酸分解酵素であることから、その活性に与える影響を評価した。質量分析の結果から、細胞内のHYAL1はC-mannosylationされているものとされていないものの2種類が存在することが示されたが、この2種類のHYAL1を分離することは困難であった。そこで、コンピュータシミュレーションによりC-mannosylationがHYAL1の酵素活性に与える影響を評価した。現在報告されているHYAL1のX線結晶構造に対し、シミュレーションソフト上でHYAL1のTrp130にマンノースを付加し、基質であるヒアルロン酸をドッキングさせ、構造の最適化を行った。その結果、HYAL1がC-mannosylationされることにより、HYAL1の活性中心であるGlu131は基質であるヒアルロン酸より遠位に存在することが示された。以上の結果から、HYAL1の酵素活性はC-mannosylationにより負に制御されていることが示唆された。
HYAL1は癌悪性化因子であることから、C-mannosylationによる機能制御という今回の新たな発見は、新たな分子標的薬の開発につながると考えられる。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Pirin regulates the epithelial to mesenchymal transition independently of Bcl3-Slug signaling. (2015)
  • Author(s): Komai, K., Niwa, Y., Sasazawa, Y. & Simizu, S.
  • Journal Title: FEBS Lett. Volume: 589 Issue: 6 Pages: 738-743
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2015.01.040
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] N-glycosylation is required for secretion and enzymatic activity of human hyaluronidase1. (2014)
  • Author(s): Goto, Y., Niwa, Y., Suzuki, T., Uematsu, S., Dohmae, N. & Simizu, S.
  • Journal Title: FEBS Open Bio Volume: 4 Issue: 1 Pages: 554-559
  • DOI: 10.1016/j.fob.2014.06.001
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] C-mannosylation of human hyaluronidase 1: Possible roles for secretion and enzymatic activity. (2014)
  • Author(s): Goto, Y., Niwa, Y., Suzuki, T., Dohmae, N., Umezawa, K. & Simizu, S.
  • Journal Title: Int. J. Oncol. Volume: 45 Issue: 1 Pages: 344-350
  • DOI: 10.3892/ijo.2014.2438
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Molecular Targets for Suppression of Metastasis : Recent Cellular Observations (2013)
  • Author(s): Simizu, S., Niwa, Y.
  • Journal Title: Forum on Immunopathological Diseases and Therapeutics Volume: 4 Pages: 43-51
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Pirin downregulates E-cadherin gene expression and contributes to EMT. (2014)
  • Author(s): Komai, K., Niwa, Y., Sasazawa, Y., and Simizu, S.
  • Organizer: EORTC-NCI-AACR Symposium on Molecular Targets and Cancer Therapeutics
  • Place of Presentation: Barcelona, Spain
  • Year and Date: 2014-11-18 – 2014-11-21
• [Presentation] ヒトDPY19L3はR-spondin1のC型糖転移酵素であり、R-spondin1の分泌を制御している (2014)
  • Author(s): 丹羽祐貴、清水史郎
  • Organizer: 第73回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県・横浜市）
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [Presentation] PirinはE-cadherin遺伝子発現を減少させることでEMTを制御している (2014)
  • Author(s): 駒井邦哉、丹羽祐貴、笹澤有紀子、清水史郎
  • Organizer: 第73回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県・横浜市）
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [Presentation] N型糖鎖修飾は、R-spondin1の機能を制御している (2014)
  • Author(s): 土屋みゆ、丹羽祐貴、笹澤有紀子、清水史郎
  • Organizer: 第73回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県・横浜市）
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [Presentation] C-mannosylationによるR-spondin1の機能制御 (2014)
  • Author(s): 丹羽祐貴、清水史郎
  • Organizer: 第23回日本がん転移学会学術集会・総会
  • Place of Presentation: 金沢ニューグランドホテル(石川県・金沢市)
  • Year and Date: 2014-07-10 – 2014-07-11
• [Presentation] R-spondin1 functions are regulated by N-glycosylation. (2014)
  • Author(s): Tsuchiya, M., Niwa, Y., and Simizu, S.
  • Organizer: 15th International Biennial Congress of the Metastasis Research Society
  • Place of Presentation: Heidelberg, Germany
  • Year and Date: 2014-06-28 – 2014-07-01
• [Presentation] N型糖鎖修飾がHYAL1機能に与える影響 (2014)
  • Author(s): 後藤祐貴、丹羽祐貴、堂前直、清水史郎
  • Organizer: 第18回日本がん分子標的治療学会学術集会
  • Place of Presentation: TKPガーデンシティ仙台（宮城県・仙台市）
  • Year and Date: 2014-06-25 – 2014-06-27
• [Presentation] 海洋産マクロリドBiselyngbyaside類の構造と生物活性 (2013)
  • Author(s): 森田真布、大野修、矢守隆夫、丹羽祐貴、清水史郎、末永聖武
  • Organizer: 日本農芸化学会関東支部2013年度支部大会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2013-11-22
• [Presentation] Secretion of R-spondin1 is regulated by C-mannosylation (2013)
  • Author(s): Niwa, Y., Simizu, S.
  • Organizer: AACR-NCI-EORTC International Conference on Molecular Targets and Cancer Therapeutics
  • Place of Presentation: Boston, MA
  • Year and Date: 2013-10-21
• [Presentation] C-mannosylationによるR-spondin1の分泌制御 (2013)
  • Author(s): 丹羽祐貴、清水史郎
  • Organizer: 第72回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2013-10-05
• [Presentation] 糖鎖修飾がHYAL1機能に与える影響 (2013)
  • Author(s): 後藤祐貴、丹羽祐貴、清水史郎
  • Organizer: 第72回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2013-10-05
• [Presentation] R-spondin1の機能に与えるC-manllosylationの役割 (2013)
  • Author(s): 丹羽祐貴、清水史郎
  • Organizer: 第22回日本がん転移学会学術集会・総会
  • Place of Presentation: 松本
  • Year and Date: 2013-07-11
• [Presentation] Involvement of glycosylation in hyaluronidase1 functions (2013)
  • Author(s): Simizu, S., Goto, Y., Niwa, Y.
  • Organizer: 9th International Conference on Hyaluronan
  • Place of Presentation: Oklahoma city, OK
  • Year and Date: 2013-06-04