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細胞間接着構造の極性形成を開始させる新規タンパク質相互作用の構造生物学的研究

Research Project

Project/Area Number 13J10057
Research Category

Grant-in-Aid for JSPS Fellows

Allocation TypeSingle-year Grants
Section国内
Research Field Structural biochemistry
Research InstitutionNara Institute of Science and Technology

Principal Investigator

柴原 豪了  奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 特別研究員(DC1)

Project Period (FY) 2013-04-01 – 2016-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2015)
Budget Amount *help
¥3,100,000 (Direct Cost: ¥3,100,000)
Fiscal Year 2015: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2014: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2013: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Keywords細胞接着 / α-catenin / merlin / X線結晶構造解析 / adherens junction / 細胞接着タンパク質 / X線結晶構造解析法
Outline of Annual Research Achievements

前年度までに、α-catenin/merlin複合体の研究において、それらの相互作用領域を特定した。また、相互作用が確認できたタンパク質領域において結晶化スクリーニングを行い、いくつかの複合体結晶を得ることができたが、分解能の改善に難航していた。
本年度は相互作用が確認できた領域のうち、これまで結晶化を試みていなかった領域について結晶化初期スクリーニングを行い、いくつかの結晶を得ることができた。結晶化に用いた溶液で得られた結晶を洗浄し、SDS-PAGEによって複合体であるかを確認した結果、αE-catenin/merlin複合体の結晶である可能性が示唆された。そのため、放射光施設でのX線回折実験を行い、分解能2.5 angstromの回折データを取得した。分子置換法による位相決定、初期モデルの構築を行い、Rwork/Rfree=20.0/24.1まで構造精密化を行った。その結果、結晶の非対称単位中に、2分子のmerlin FERM (19-314)ドメインが存在していた。2分子のmerlin FERM (19-314)ドメインに対して、2分子のαE-catenin由来の電子密度が確認できた。決定した結晶構造から、merlin FERM (19-314)ドメインのサブドメインCに位置するα1Cとβ5Cの間に形成される疎水性の溝に、αE-cateninがβシートを形成して相互作用していた。
結晶構造からα-cateninとの相互作用に重要なmerlinのアミノ酸残基として、疎水性アミノ酸残基Leu297とIle301が示唆された。それらをグルタミン酸に置換したmerlin FERM (19-314) I301E変異体、L297E I301E変異体を調製して、αN-catenin D1ドメイン (1-261) との相互作用解析を行った。その結果、merlin FERM (19-314) WTと比較して、各merlin FERM (19-314) 変異体とαN-catenin (1-261) との相互作用が著しく阻害された。このことから、merlinのLeu297とIle301は、α-cateninとの相互作用に重要な残基として機能していることが示された。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Report

(3 results)
  • 2015 Annual Research Report
  • 2014 Annual Research Report
  • 2013 Annual Research Report
  • Research Products

    (2 results)

All 2015

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results,  Open Access: 1 results) Presentation (1 results)

  • [Journal Article] Structure of the free form of the N-terminal VH1 domain of monomeric α-catenin.2015

    • Author(s)
      Shibahara T, Hirano Y, Hakoshima T.
    • Journal Title

      FEBS Letter

      Volume: 589 Issue: 15 Pages: 1754-1760

    • DOI

      10.1016/j.febslet.2015.05.053

    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] α-catenin VH1ドメインの遊離型単量体の結晶構造解析2015

    • Author(s)
      Shibahara, T.
    • Organizer
      第38回 日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド(兵庫県神戸市)
    • Year and Date
      2015-12-01
    • Related Report
      2015 Annual Research Report

URL: 

Published: 2014-01-29   Modified: 2024-03-26  

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