新しい機能性遺伝子同定技術の創出と成人病性血管障害関連遺伝子探索への応用

• Project/Area Number: 14013025
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 米倉 秀人 金沢大学, 医学系研究科, 助教授 (80240373)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山本 靖彦 金沢大学, 医学系研究科, 助手 (20313637) ; 渡辺 琢夫 金沢大学, 医学系研究科, 助教授 (40303268) ; 山本 博 金沢大学, 医学系研究科, 教授 (00115198)
• Project Period (FY): 2002
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2002)
• Budget Amount: ¥5,300,000 (Direct Cost: ¥5,300,000); Fiscal Year 2002: ¥5,300,000 (Direct Cost: ¥5,300,000)
• Keywords: functional genomics / gene screening / antisense oligonucleotide / antisense display / angiogenesis / vascular endothelial cells / cDNA cloning / genome database screening

Research Abstract

本研究の目的は、任意の表現形質を担う遺伝子を機能面から系統的かつ簡便に同定する技術として代表者らが独自に考案したAntisense Display法を新しい機能性遺伝子スクリーニング技術として確立し、成人病性血管障害関運遺伝子、特に血管新生抑制性遺伝子の分離に適用することである。平成14年度の研究で、以下の成果を得た。
1.平成13年度に行なった血管新生関連遺伝子のスクリーニングで同定された、血管内皮細胞の増殖促進を示す10mer陽性アンチセンスプールの高次スクリーニングを以下のとおり行なった。陽性プールに含まれていた16種のアンチセンス配列を単独でスクリーニングし、単一の陽性配列を同定した。続いて当該配列の鎖長を12merに延長した16種のアンチセンス配列を調製してスクリーニングを行ない、単一の陽性配列を同定した。さらに当該配列の鎖長を14merに延長した16種のアンチセンス配列を調製してスクリーニングを行ない、血管内皮細胞の増殖促進を示す単一の14mer配列を同定した。
2.同定したアンチセンス配列を基にRT-PCRクローニングを行ない、上記14mer配列を有するcDNAをヒト血管内皮細胞より分離し、その配列を決定した。
3.決定した配列でヒトゲノムデータベースのサーチを行なったところ、当該配列はこれまで全く報告されていない新規の遺伝子で、11番染色体上に位置していることが明らかになった。
4.後期糖化反応生成物(advanced glycation endproducts, AGE)による周皮細胞喪失(pericyte loss)に関係する遺伝子をスクリーニングするため、改良Antisense Display法のヒト血管周皮細胞への適用をスタートした。

Research Products

• [Publications] Petrova, G. et al.: "Advanced glycation endproduct-induced calcium handling impairment in mouse cardiac myocytes"J.Mol.Cell.Cardiol.. 34(10). 1425-1431 (2002)
• [Publications] Yonekura, H. et al.: "RAGE engagement and vascular cell derangement by short chain sugar-derived advanced glycation endproducts"Excerpta Medica International Congress Series. 1245. 129-135 (2002)
• [Publications] Yamamoto, Y. et al.: "The role of AGE-RAGE system in the development of diabetic nephropathy in vivo"Excerpta Medica International Congress Series. 1245. 45-50 (2002)
• [Publications] Sakurai, S. et al.: "Identification of a novel AGE-capturable soluble variant of the RAGE in human sera"Excerpta Medica International Congress Series. 1245. 163-167 (2002)
• [Publications] Yamagishi, S. et al.: "Advanced glycation end products-induced apoptosis and overexpression of vascularendothelial growth factor in bovine retinal pericytes"Biochem Biophys Res Commun. 290(3). 973-978 (2002)
• [Publications] Yonekura, H. et al.: "Novel splice variants of the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) expressed in human vascular endothelial cells and pericytes, and their putative roles in diabetes-induced vascular injury"Biochem.J.. 370(3). 1097-1109 (2003)
• [Publications] Miura J. et al.: "Serum levels of non-carboxymethyllysine advanced glycation endproducts are correlatedto severity of microvascular complications in patients with Type 1 diabetes"J Diabetes Complications. 17(1). 16-21 (2003)
• [Publications] Sakurai, S. et al.: "The AGE-RAGE system and diabetic nephropathy"J.Am.Soc.Nephrol.. (in press). (2003)
• [Publications] Unoki H. et al.: "Cyr61 Upregulation in Vascular Smooth Muscle Cells of Spontaneously Hypertensive Rats"Lab.Invest.. (in press). (2003)
• [Publications] Kim, Y.M.et al.: "PNUTS, a protein phosphatase 1 (PP1) nuclear targeting subunit: Characterization of its PP1-and RNA-binding domains and regulation by phosphorylation"J Biol Chem.. (in press). (2003)
• [Publications] Miura J. et al.: "AGE downregulation of monocyte expression of RAGE mRNA and its association with diabetic complications in type 1 diabetes"J Diabetes Complications. (in press). (2003)
• [Publications] 米倉秀人: "新しい機能性遺伝子スクリーニング法-アンチセンスディスプレイ法-の開発と新規遺伝子探索への適用"バイオサイエンスとインダストリー((財)バイオインダンストリー協会). 60(7). 36-37 (2002)