| Project/Area Number |
14042204
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Science and Engineering
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
後藤 順一 東北大学, 医学部附属病院, 教授 (80006337)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
丹羽 俊文 東北大学, 医学部, 助教授 (90218248)
小林 典裕 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (90205477)
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| Project Period (FY) |
2002 – 2003
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2003)
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| Budget Amount *help |
¥4,200,000 (Direct Cost: ¥4,200,000)
Fiscal Year 2003: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 2002: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
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| Keywords | 内分泌撹乱物質 / ハイスループット / スクリーニング / エストラジオール / 抗体 / 遺伝子クローニング / 相補性決定部 / CDRシャッフリング / ハプテン / モノクローナル抗体 / ELISA |
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| Research Abstract |
環境中女性ホルモン様物質の影響を精査するために、エストラジオール(E_2)のハイスループットスクリーニング法が切望され、高親和力で特異的な抗体が求められている。野生型抗体の相補性決定部(CDR)にランダム変異を導入することにより高性能な改変抗体の創製が可能と期待される。そこで、error-prone PCRにより得られる変異CDR遺伝子断片を野生型抗体のフレームワーク(FR)遺伝子にランダムに組み込む"CDRシャッフリング"に基づく変異抗E_2抗体の創製を企てた。先に樹立した抗E_2抗体産生ハイブリドーマ株よりRNAを単離し、RT-PCRによりH鎖及びL鎖可変部(V_H,V_L)遺伝子をクローニングした。これらを連結して一本鎖Fvフラグメント(scFv)の遺伝子を構築し、その産物である野生型scFvを用いて競合ELISAを行った結果、遊離E_2添加量2-200ngにおいて用量作用曲線が得られた。本scFv遺伝子を鋳型として0.5又は1.0mM MnCl_2存在下でerror-prone PCRを行い、変異クローン27種のV_H及びV_L塩基配列を解析したところ、最大13%の高い効率で点変異の導入が認められた。その一方で、V_H、V_L各ドメインに対応する遺伝子の全長をそれぞれ6本の一本鎖合成オリゴDNA(5'側から#1〜#6;およそ60〜120merの範囲)に分解し,これをrecursive PCRに付すことで元のscFv遺伝子が再構成されることを確認した。得られた変異scFv遺伝子群のCDR部分をPCRにより増幅することで、変異CDR遺伝子断片群(#2、3、5に相当)を調製することができる。これらを野生型FR遺伝子断片(#1、#4、#6に相当)と混合してrecursive PCRに付すことで得られるCDRシャッフリングライブラリーから、親和力と特異性に優れる変異抗体の探索が可能と期待される。
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