シナプスにおけるエンドサイトーシス機能タンパク-膜リン脂質相互作用の解析

• Project/Area Number: 14380306
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: Functional biochemistry
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 絹田 正裕 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 講師 (40135942)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹居 孝二 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (40322226) ; 山田 浩司 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (80325092)
• Project Period (FY): 2002 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥10,700,000 (Direct Cost: ¥10,700,000); Fiscal Year 2004: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,600,000); Fiscal Year 2003: ¥2,900,000 (Direct Cost: ¥2,900,000); Fiscal Year 2002: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥5,200,000)
• Keywords: エンドサイトーシス / 小胞輸送 / 無細胞系 / アンフィファシジン / リポソーム / ダイナミン / シナプス小胞 / アンフィフィジン / 膜リン脂質 / ARF6 / Cdk5 / p35 / アンフィファイジン / 動的光散乱法 / Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate / ADP-ribosylation factor / Cyclin-dependent kinase 5

Research Abstract

Amphiphysin 1によるDynamin GTPase活性の上昇
Dynamin 1GTPアーゼ活性に対するAmphiphysin 1と膜脂質の影響を調べ、Amphiphysin 1が、大型リポゾームの存在下にDynamin 1のGTPアーゼ活性を上昇することを明らかにした。リポゾームにフォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール2リン酸などの酸性リン脂質を含まれる場合、特にGTPアーゼ活性の増強効果が高かった。ミュータントAmphiphysin 1を用いた解析により、Dynamin 1GTPアーゼ活性の増強には膜脂質への結合を担うBARドメインと、dynaminとの結合ドメインであるSH3ドメインが必要でであることを明らかにした。また、クラスリン結合部位、AP2結合部位を含む中間部は、Dynamin 1GTPアーゼ活性に対して抑制的に働くことが示唆された。
Amphiphysin 1によるDynamin 1と膜脂質の結合の増加
リポゾームを用いた結合実験により、Amphiphysin 1がDynamin 1と膜脂質の結合を増加させることを明らかにした。この結合増加の一因は、Amphiphysin 1のBARドメインとSH3ドメインを介した間接的結合によるものであることを、ミュータントAmphiphysin 1を用いた解析により明らかにした。
Amphiphysin 1とDynamin 1と脂質膜の結合増加
ミュータントAmphiphysin 1を用いた解析により,Amphiphysin 1とDynamin 1のリング形成にはBARドメインとSH3ドメインが必要であることを明らかにした。また、リング形成とDynamin 1 GTPアーゼ活性の上昇が、Dynamin 1と膜結合性にある程度相関することを示唆した。
以上の成果を論文にまとめ発表した。

Research Products

• [Journal Article] The stimulatory action of amphiphysin on dynamin function is dependent on lipid bilayer curvature. (2004)
  • Author(s): Y.Yoshida et al.
  • Journal Title: EMBO Journal (印刷中)
• [Publications] Krauss M, Kinuta M et al.: "ARF6 stimulates clathrin/AP-2 recruitment to synaptic membranes by activating Phosphatidylinositol phosphate kinase type Iγ."Journal of Cell Biology. 162・1. 113-124 (2003)
• [Publications] Tomizawa et al.: "Cophosphorylation of amphiphysin 1 and dynamin 1 by Cdk5 regulates clathrin-mediated endocytosis of synaptic vesicles"Journal of Cell Biology. 163・4. 813-824 (2003)
• [Publications] Kinuta M et al.: "Formation of S-[2-carboxy-1-(1H-imidazol-4-yl)ethyl]glutathione, a new metabolism of L-histidine, from cis-urocanic acid and glutathione by the action of glutqthione S-transferase"Electrophoresis. 24. 3212-3218 (2003)
• [Publications] 絹田正裕, 竹居孝二: "イノシトールリン脂質によるエンドサイトーシスの制御機構"生化学(ミニレビュー). 75・11. 1449-1452 (2003)
• [Publications] Yoshida Y, Kinuta M et al.: "Stimulatory effect of amphiphysin an dynamin-dependent vesicle formation and effect of bilayer cuvature on amphiphysin function"Nature Cell Biology. (In submittion).
• [Publications] 絹田正裕: "神経シナプスにおけるエンドサイトーシス機能タンパク質-膜リン脂質相互作用機序の人工脂質膜を用いた解析法"岡山医学会雑誌(総説). 116・1(印刷中). (2004)
• [Publications] Kinuta M. et al.: "Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate stimulates vesicle formation from liposomes by brain cytosol"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99・5. 2842-2847 (2002)
• [Publications] Kinuta M., Takei K.: "Utilization of liposomes in vesicular transport studies. Review"Cell Struc. Funct.. 27・2. 63-69 (2002)
• [Publications] Kamitani A. et al.: "Distribution of dynamins in testis, and their possible relation to spermatogenesis"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 294・2. 261-267 (2002)
• [Publications] Krauss M., Kinuta M.et al.: "ARF6 stimulates clathrin/AP-2 recruitment to synaptic membranes by activating phosphatidylinositol phosphate kinase type Iγ"J. Cell Biol.. (in press). (2003)
• [Publications] Tomizawa K. et al.: "Cdk5/p35-Dependent phosphorylation of amphiphysin and dynamin I : Critical role in clathrin-mediated endocytosis of synaptic vesicle"Neuron. (in press). (2003)
• [Publications] Kinuta M. et al.: "Formation of S-[2-carboxy-1-(1H-imidazol-4-yl)ethyl]glutatione, a new metabolite of L-histidine, from cis-urocanic acid and glutathione by the action of glutathione S-transferase"Electrophoresis. 24(in press). (2003)