| Project/Area Number |
14656069
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
林産学
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
杉山 淳司 京都大学, 木質科学研究所, 助教授 (40183842)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
馬場 啓一 京都大学, 木質科学研究所, 助手 (20238223)
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| Project Period (FY) |
2002 – 2003
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2003)
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| Budget Amount *help |
¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,900,000)
Fiscal Year 2003: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Fiscal Year 2002: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
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| Keywords | ポストゲノム / セルロース合成酵素 / 酢酸菌 / 昆虫細胞発現系 / CesA / リコンビナントタンパク質 / 電子線結晶学 |
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| Research Abstract |
セルロース合成酵素を高分解能で三次元構造解析するためにHis-tagを付加したリコンビナントセルロース合成酵素を大量に生産することを目的とした。またこれを精製する条件を検討した。酢酸菌セルロース合成酵素オペロンの触媒サブユニットBcsAに相当する遺伝子をバキュロウイルスベクターに導入し、昆虫細胞にトランスフェクションして、His-tagを付加したリコンビナントセルロース合成酵素を発現させることに成功した。リコンビナントセルロース合成酵素が最も大量に生産される培養条件を、ウイルスの感染時間、細胞濃度、MOI、細胞の状態の観点から接着および懸濁培養について検討した。その結果、ウイルスの感染時間は接着培養においては48-60時間、懸濁培養においては60時間が最適であることが判った。また細胞濃度については1.8〜2.0×10^6cells/mlが適しており、ウイルスの感染は継代から約1日経過した細胞が適していた。MOIは4〜5が適していた。次に膜画分を作製して目的タンパク質が膜で発現していることを確認した。この結果は膜タンパク質であるセルロース合成酵素が適切な三次元構造を保った状態で発現している可能性が高いことを示唆している。膜画分の洗いに最適な条件を検討したところ、目的タンパク質の流出が少ない0.2Mの炭酸ナトリウムを用いること、またバッファーにはPBSが適していることが判った。洗浄後の可溶化については、7種類の界面活性剤をいくつかの濃度で試験したところ、n-Decyl-β-D-maltosideが適していると思われた。また試料を凍結させると洗浄や可溶化に悪影響を及ぼすことも判った。またセルロース合成酵素の遺伝子資源として、細胞濃度や増幅時間を変えてウイルスを作製し保存した。さらにこれら数種類のウイルスからセルロース合成酵素をそれぞれ発現させ保存した。
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