上皮幹細胞を用いた自家培養口腔粘膜の短期間で高能率な作製法の開発

• Project/Area Number: 14657468
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Morphological basic dentistry
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 田中 輝男 九州大学, 歯学研究院, 教授 (60077667)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山座 孝義 九州大学, 歯学研究院, 助手 (80304814) ; 城戸 瑞穂 九州大学, 歯学研究院, 助教授 (60253457)
• Project Period (FY): 2002 – 2003
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2003)
• Budget Amount: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,600,000); Fiscal Year 2003: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2002: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
• Keywords: 口腔上皮細胞 / 培養方法 / 温度感受性 / 幹細胞 / 粘膜固有層 / 口腔粘膜 / 自家培養 / ラット / 組織幹細胞 / 上皮 / 大量培養 / 温度応答性培養皿 / ポリN-イソプロピルアクリルアミド

Research Abstract

生後1〜3日の新生児ラットから口腔粘膜(頬粘膜)を採取した。口腔粘膜上皮を粘膜固有層から分離するために、ディスパーゼ処理を施し、その後、ピンセットにて、上皮を慎重に剥離した。
口腔粘膜固有層の組織片をαMEM中で十分に細切して、ストレーナーで、余分な組織を除去したのち、カルチャーディッシュに播種した。10%FBS添加αMEMにて、約80%程度のサブコンフルエントな状態にまで培養すると、酵素処理にて線維芽細胞を剥離し、6代まで継代培養した。増殖させた線維芽細胞を、コラーゲンゲル内で培養した。しかしながら、コラーゲンゲルを種々の厚さにして培養した場合、その厚みが増すと、3次元的な線維芽細胞の培養を行っている途中で、細胞の増殖が停滞・ときには細胞死が生じた。コラーゲンゲルの厚みの検討を現在行っているため、技術的に十分な培養口腔粘膜固有層の作製には至ってない。
次に、分離した口腔粘膜上皮を用いて、上皮底面を機械的に擦り、上皮細胞を多く分離させた後、上皮細胞専用の無血清培地にて分離培養した。種々の表面抗原をマーカーにして、FACSにて、上皮幹細胞の単離に挑戦した。しかしながら、1度に採取できる上皮幹細胞の数が少ないためか、分離してきた細胞が組織幹細胞として、的確でなかったためか、上皮細胞が十分にシート状に培養できなかった。口腔上皮から分離した上皮細胞を、上述のコラーゲンの上で培養すると、シート状の培養上皮は作製可能であったが、2〜3週間必要で、その大きさが小さいため、培養上皮シートの迅速かつ大量な作製を目指した本研究の目的には適していなかった。現在、上皮幹細胞のFACSによる分離・培養法を検討中である。