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新たなヒトモノクローナル抗体の作成とその臨床応用への検討

Research Project

Project/Area Number 14770082
Research Category

Grant-in-Aid for Young Scientists (B)

Allocation TypeSingle-year Grants
Research Field Human pathology
Research InstitutionKeio University

Principal Investigator

橋口 明典  慶應義塾大学, 医学部, 助手 (50276218)

Project Period (FY) 2002 – 2003
Project Status Completed (Fiscal Year 2003)
Budget Amount *help
¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,900,000)
Fiscal Year 2003: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Fiscal Year 2002: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Keywordsヒト抗体 / ベロ毒素 / CD26
Research Abstract

ベロ毒素、ならびにヒトCD26を、ヒト末梢血リンパ球を移植したCB-17 SCIDマウス(SCID-huPBL)に免疫し、脾臓に集積したヒトリンパ球より、可変領域のcDNAライブラリーを得た。アセンブリPCR法により、γ鎖とκ鎖、γ鎖とλ鎖、それぞれを対にして組み合わせ、ファージミドベクターに組み込み、single chain Fv (scFv) cDNAライブラリーの作製に成功した。
ファージ・ディスプレー法にて、それぞれ目的の抗原と結合するクローンを濃縮し、ELISA法にて陽性を示すクローンを多数得た。
ELISAにて、抗原量に比例してシグナル強度があがる特異性の高いクローンを選択し、大量精製を目的として、ヒスチジン・タグを付加するタンパク発現系への組み換えを行った。組み換え後も、ヒスチジン・タグを有する30kDの安定した蛋白の発現をイムノブロッティング法にて確認した。
これらのクローンについては、それぞれ塩基配列を決定し、各々は、塩基配列の異なる独立したクローンであることを確認した。各クローンの遺伝子産物をイムノブロッティング法にて解析したところ、それぞれ約30kDの安定した蛋白(scFv)を産生することが明らかとなった。
各クローンは、Niイオン親和性クロマトグラフィーにて約90%以上の純度で精製に成功した。
細胞表面上のCD26の認識が可能か検討する目的で、CD26を導入したJurkat細胞株に精製scFvを作用させ、二次抗体に、FITC結合抗mycエピトープ抗体を用いて、フローサイトメーターにて検討した。陰性コントロールとして、CD26を導入していないJurkat細胞の親株を用いた。各クローンとも、特異的陽性所見が得られた。

Report

(2 results)
  • 2003 Annual Research Report
  • 2002 Annual Research Report

URL: 

Published: 2002-04-01   Modified: 2016-04-21  

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