褐藻類における機能性オリゴ糖の生産に向けた有用酵素の機能解析及び改変

• Project/Area Number: 14J04026
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Aquatic life science
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 熊谷 祐也 北海道大学, 農学研究院, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2014-04-25 – 2017-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2016: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2015: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2014: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: ラミナリン / オリゴ糖 / ラミナリナーゼ / 糖質加水分解酵素 / ラミナリオリゴ糖 / 糖質結合モジュール / ウロン酸多糖 / β１→３グルカン / GH64

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題は機能性を有するラミナリオリゴ糖の基本骨格を明らかにし、それにより糖質の構造と機能発現の関連性の解明を目的としている。具体的には、酵素工学的手法によりラミナリオリゴ糖を調製する方法の開発および高い機能性を有する基本構造の作製を目指した。本年度は採用の３年目であり、研究は順調に進捗した。昨年度に引き続き水産軟体動物のβ-グルカナーゼから得られた新たな糖質結合ドメインの機能解析を行った。これまでに本ドメインはアルギン酸などの酸性多糖に結合することが明らかとなったが、その結合の強さは明らかでない。その解析のため、Birte Svensson教授が在籍するTechnical University of Denmarkで研究活動を行った。当教授は酵素・タンパク質工学が専門であり、現在は様々な糖質とタンパク質の相互作用について研究している。当該年度における研究目標はその糖質認識ドメインと糖質の相互作用の強さを明らかにすることである。可溶性糖質とタンパク質の結合力の測定はアフィニティーゲル、表面プラズモン共鳴、等温滴定型カロリメトリーが挙げられる。アフィニティーゲルはタンパク質のテーリングが起こり正確な結合力を出すのが難しく、等温滴定型カロリメトリーは主に１：１の結合力を求める装置であり、本タンパク質と糖質の相互作用は凝集を引き起こすため正確な値が得られなかった。表面プラズモン共鳴ではその結合力を評価でき、解離定数2×10-8 （Ｍ）を求めた。また本ドメインは塩により結合能が異なる。表面プラズモン共鳴は塩濃度の異なる条件下での測定も可能であり、その評価についても本装置で測定が可能であることが分かった。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] デンマーク工科大学(デンマーク)
• [Int'l Joint Research] Technical University of Denmark(Denmark)
• [Journal Article] Molecular insights into the thermal stability mechanism of actinomycete mannanase (2016)
  • Author(s): Kumagai, Y., Uraji, M., Wan, K., Okuyama, M., Kimura, A., and Hatanaka, T.
  • Journal Title: FEBS Letters Volume: 590 Issue: 17 Pages: 2862-2869
  • DOI: 10.1002/1873-3468.12322
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] <b>Megalo-type α-1,6-glucosaccharides induce production of tumor necrosis factor α in primary macrophages via toll-like receptor 4 </b><b>signaling </b> (2016)
  • Author(s): Joe, G.H., Andoh, M., Shinoki, A., Lang, W., Kumagai, Y., Sadahiro, J., Okuyama M., Kimura, A., Shimizu, H., Hara, H., and Ishizuka, S.
  • Journal Title: Biomedical Research Volume: 37 Issue: 3 Pages: 179-186
  • DOI: 10.2220/biomedres.37.179
  • NAID: 130005161058
  • ISSN: 0388-6107, 1880-313X
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Heat treatment of curdlan enhances the enzymatic production of biologically active β-(1,3)-glucan oligosaccharides (2016)
  • Author(s): Kumagai Y, Okuyama M, Kimura A
  • Journal Title: Carbohtdr. Polym. Volume: - Pages: 396-401
  • DOI: 10.1016/j.carbpol.2016.03.066
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The loop structure of Actinomycete glycoside hydrolase family 5 mannanases governs substrate recognition (2015)
  • Author(s): Kumagai Y, Yamashita K, Tagami T, Uraji M, Wan K, Okuyama M, Yao M, Kimura A, Hatanaka T
  • Journal Title: FEBS J. Volume: 282 Issue: 20 Pages: 4001-4014
  • DOI: 10.1111/febs.13401
  • NAID: 120005906892
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Biochemical properties and substrate recognition mechanism of GH31 α-glucosidase from Bacillus sp. AHU 2001 with broad substrate specificity (2015)
  • Author(s): Wataru Saburi, Masayuki Okuyama, Yuya Kumagai, Atsuo Kimura, Haruhide Mori
  • Journal Title: Biochimie Volume: 108 Pages: 140-148
  • DOI: 10.1016/j.biochi.2014.11.010
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Different molecular complexity of linear-isomaltomegalosaccharides and β-cyclodextrin on enhancing solubility of azo dye ethyl red: Towards dye biodegradation (2014)
  • Author(s): Weeranuch Lang, Yuya Kumagai, Juri Sadahiro, Janjira Maneesan, Masayuki Okuyama, Haruhide Mori, Nobuo Sakairi, Atsuo Kimura
  • Journal Title: Bioresource Technology Volume: 169 Pages: 518-524
  • DOI: 10.1016/j.biortech.2014.07.025
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Vibrio由来glycoside hydrolase family 17の機能未知なC末端領域は酵素活性の発現に必須である． (2017)
  • Author(s): 熊谷祐也、田上貴祥、奥山正幸、木村淳夫．
  • Organizer: 日本農芸化学会2017年度大会
  • Place of Presentation: 京都府、京都市、京都女子大学
  • Year and Date: 2017-03-17
• [Presentation] GH5_8マンナナーゼの熱安定化メカニズムの解明 (2016)
  • Author(s): 熊谷祐也、裏地美杉、Wan Kun、奥山正幸、木村淳夫、畑中唯史．
  • Organizer: 第68回日本生物工学会大会
  • Place of Presentation: 富山県、富山市、富山国際会議場-ANAクラウンプラザホテル
  • Year and Date: 2016-09-28
• [Presentation] 水産軟体動物のグルカナーゼに付随する機能未知領域の機能解析 (2016)
  • Author(s): 熊谷祐也、Abou Hachem Maher、Birte Svensson、尾島孝男、奥山正幸、木村淳夫
  • Organizer: 日本応用糖質科学会平成28年度大会
  • Place of Presentation: 広島県、福山市、広島県民文化センターふくやま(エストパルク)
  • Year and Date: 2016-09-14
• [Presentation] Functional isomalto- megalosaccharide synthesized by enzymatic decoration. (2016)
  • Author(s): Kumagai. Y., Lang, W., Sadahiro, J., Okuyama, M., Hara, H., and Kimura, A.
  • Organizer: International Carbohydrate Symposium -ICS 2016
  • Place of Presentation: New Orleans, LA
  • Year and Date: 2016-06-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Solubilizing ability of double-anchor type isomaltomegalosaccharide for drug delivery of ibuprofen (2016)
  • Author(s): Sota Uekusa, Weeranuch Lang, Yuya Kumagai, Masayuki Okuyama, Atsuo Kimura
  • Organizer: 日本農芸化学会(2015年度大会)
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター(北海道・札幌市)
  • Year and Date: 2016-03-27
• [Presentation] Enzymatic synthesis of functional linear isomaltomegalosaccharide by Gluconobacter oxydans dextran dextrinase (2015)
  • Author(s): Yuya Kumagai, Weeranuch Lang, Juri Sadahiro, Masayuki Okuyama, Haruhide Mori, and Atsuo Kimura
  • Organizer: 11th Carbohydrate Bioengineering Meeting (CBM11)
  • Place of Presentation: Espoo, Finland
  • Year and Date: 2015-05-10
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 生理活性を持つβ‐１，３－グルカンオリゴ糖の酵素的調製法の検討 (2015)
  • Author(s): 熊谷祐也,奥山正幸, 木村淳夫
  • Organizer: 日本農芸化学会
  • Place of Presentation: 岡山県、岡山市、岡山大学津島キャンパス
  • Year and Date: 2015-03-26
• [Presentation] 放線菌マンナナーゼの基質特異性に関するループ7の解析 (2014)
  • Author(s): 熊谷祐也, 裏地美杉, 奥山正幸, 木村淳夫, 畑中唯史
  • Organizer: 日本応用糖質科学会
  • Place of Presentation: 新潟県、新潟市・朱鷺メッセ新潟コンベンションセンター
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-26
• [Presentation] 放線菌マンナナーゼの分枝オリゴ糖に対する基質特異性に関する解析 (2014)
  • Author(s): 熊谷祐也, 裏地美杉, 奥山正幸, 木村淳夫, 畑中唯史
  • Organizer: 日本生物工学会
  • Place of Presentation: 北海道、札幌市・札幌コンベンションセンター
  • Year and Date: 2014-09-15
• [Remarks] 研究室HP
  • URL: http://www.agr.hokudai.ac.jp/molenzlab/