エピゲノムマーキングによるキスペプチン発現制御メカニズムの解明

• Project/Area Number: 14J10751
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Integrative animal science
• Research Institution: National Institute for Physiological Sciences (2015); Nagoya University (2014)
• Principal Investigator: 後藤 哲平 生理学研究所, 行動・代謝分子解析センター, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2014-04-25 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000); Fiscal Year 2015: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2014: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: キスペプチン / エンハンサー / クロマチン免疫沈降 / 不死化細胞 / p300 / 転写因子 / ChIPアッセイ / クロマチン構造 / 視床下部弓状核

Outline of Annual Research Achievements

視床下部サンプルにおけるエンハンサー特異的なヒストン修飾のクロマチン免疫沈降解析を行い、UCSCゲノムブラウザーへマッピングを行った。その結果、マウスゲノム上に1000-2400カ所程度のエンハンサー特異的ヒストン修飾の豊富な領域があることがわかった。一方、これら領域にはKiss1遺伝子座は含まれていなかった。ARCのKiss1遺伝子エンハンサー候補領域10 kb内を詳しく調べると、ARCサンプルではエンハンサー特異的ヒストン修飾を受け、なおかつAVPVサンプルでは修飾を受けていない領域が存在していた。しかし、マッピングされたシグナルの絶対数が少なく、真のシグナルかどうか判断が困難であった。その原因はサンプルがキスペプチンニューロン以外の細胞を多く含んでいるためであると考えられる。そこで、キスペプチンニューロンに緑色蛍光タンパクを発現するKiss1-GFPマウスの胎児視床下部を初代培養しSV40T-antigenによって不死化を試みた。一度継代後、SV40T-antigenを導入すると緑色蛍光は消失したが、不死化自体には成功した。不死化細胞を単一クローンに分離して、クローン化を行い、複数のKiss1-GFPマウス由来の不死化細胞株を得ることに成功した。CRISPR/Casシステムを所属研究室にて確立し、視床下部不死化細胞においてCRISPRを使ってKiss1遺伝子プロモーター付近にエピジェネィック修飾タンパク質p300を強制発現させると、Kiss1発現が上昇した。よって、キスペプチンの発現制御には少なくともエピジェネティック修飾タンパクp300が関連することが示唆された。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Hypomorphic phenotype of Foxn1 gene-modified rats by CRISPR/Cas9 system. (2016)
  • Author(s): Goto T, Hara H, Nakauchi H, Hochi S, Hirabayashi M.
  • Journal Title: Transgenic Research Volume: 印刷中 Issue: 4 Pages: 533-544
  • DOI: 10.1007/s11248-016-9941-9
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Molecular and Epigenetic Mechanism Regulating Hypothalamic Kiss1 Gene Expression in Mammals. (2016)
  • Author(s): Uenoyama Y, Tomikawa J, Inoue N, Goto T, Minabe S, Ieda N, Nakamura S, Watanabe Y, Ikegami K, Matsuda F, Ohkura S, Maeda KI, Tsukamura H.
  • Journal Title: Neuroendocrinology Volume: 印刷中 Issue: 6 Pages: 640-649
  • DOI: 10.1159/000445207
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Identification of hypothalamic arcuate nucleus-specific enhancer region of kiss1 gene in mice. (2015)
  • Author(s): Goto, T., Tomikawa, J., Ikegami, K., Minabe, S., Abe, H., Fukanuma, T., Imamura, T., Takase, K., Sanbo, M., Tomita, K., Hirabayashi, M., Maeda, K., Tsukamura, H., Uenoyama, Y.
  • Journal Title: Mol Endocrinol Volume: 29 Issue: 1 Pages: 121-129
  • DOI: 10.1210/me.2014-1289
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Hypothalamic arcuate nuleus-specific enhancer for kisspeptin expression of female mice (2014)
  • Author(s): Goto T, Tsukamura H, Tomikawa J, Abe H, Fukanuma T, Imamura T, Takase K, Sanbo M, Tomita K, Hirabayashi M, Maeda KI, Uenoyama Y.
  • Organizer: The 3rd World Congress on Reproductive Biology (WCRB)
  • Place of Presentation: エジンバラ（スコットランド）
  • Year and Date: 2014-09-03
• [Presentation] キスペプチンノックアウトマウス由来の卵子および精子の受精能の検討 (2014)
  • Author(s): 後藤哲平、平林真澄、前多敬一郎、束村博子、上野山賀久
  • Organizer: 第107回日本繁殖生物学会
  • Place of Presentation: 帯広畜産大学（北海道・帯広市）
  • Year and Date: 2014-08-21