一塩基多型(SNPs)検出のための修飾DNAアプタマーの創製

Research Project

Project/Area Number	15011205
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Allocation Type	Single-year Grants
Review Section	Biological Sciences
Research Institution	Gunma University
Principal Investigator	桑原正靖群馬大学, 工学部, 助手 (40334130)
Project Period (FY)	2003
Project Status	Completed(Fiscal Year 2003)
Budget Amount *help	¥2,600,000 (Direct Cost : ¥2,600,000) Fiscal Year 2003 : ¥2,600,000 (Direct Cost : ¥2,600,000)
Keywords	核酸 / 有機化学 / バイオテクノロジー / 生体生命情報学
Research Abstract	酵素や抗体のような活性をもつDNAやRNAが試験管内選択法によって創製されている。このような機能を有する核酸分子(DNA/RNA)の更なる活性の向上や機能の多様化を狙って、タンパク質に見られる官能基を導入した修飾DNAに試験管内選択法を応用する試みがある。そのためには修飾核酸の簡便な酵素的合成法が必要である。これまでポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって複数の修飾ヌクレオチドが導入された修飾DNAの酵素的合成は困難であった。本研究では耐熱性DNAポリメラーゼが触媒するPCRの基質となる修飾TTPと修飾dCTPおよび修飾dATPを合成した。複数の修飾ヌクレオシド三リン酸を用いてPCRアッセイを行ったところ、プロピニルリンカーをもつ修飾TTPとメチルアミドリンカーをもつ修飾dCTPを同時に用いた酵素反応系が最も収率よく二重修飾DNAを与えた。また、修飾DNAの酵素的合成に適したポリメラーゼの探索を行ったところ、遺伝子進化ファミリーBに属するKOD Dash DNAポリメラーゼとVent(exo-)DNAポリメラーゼが有用であることが分かった。これらの酸素-修飾基質反応系を用いたPCRにより、ヒドロキシル基やニトリル基、アミノ基、グアニジノ基などを有する二重修飾DNAを簡便に調製できる方法を確立した。次に、アミノ基が修飾されたDNAを用いてDNAのシングルミスマッチ構造を認識するアプタマーの創製を試みた。フルマッチ二重鎖をネガティブ・ターゲット、シングルミスマッチ二重鎖DNAをポジティブ・ターゲットとした試験管内選択法により、CAミスマッチを認識するものを選択する操作を繰り返したところ、ターゲットに結合する修飾DNAの割合は、1ラウンド目では全体の2.4%に過ぎなかったが、6ラウンド終了後には26%まで増加した。今後、目的の活性を持つ修飾DNAを単離し配列解析や機能評価を行う。