プラステイン反応を利用した血圧低下ペプチドの連続合成

• Project/Area Number: 15658045
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Food science
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 松井 利郎 九州大学, 大学院・農学研究院, 助教授 (20238942)
• Project Period (FY): 2003 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000); Fiscal Year 2004: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000); Fiscal Year 2003: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
• Keywords: 血圧低下ペプチド / ペプチド合成 / プラステイン反応 / 高血圧

Research Abstract

化学合成されたペプチドの降圧食品素材への適用が不可能な現状で、当該保健食品の開発・研究はすべて天然蛋白質からの酵素分解を主体としている。そこで本研究では、従来の研究アプローチとは全く逆の過程、すなわち加水分解酵素の逆合成反応を利用した天然アミノ酸からの活性ペプチドの連続生産を目指した。本年度においては、最適加水分解酵素のプラステイン反応性(脱水縮合によるペプチド合成反応)に関わる合成条件(酵素剤の選択、反応条件、添加剤)を明らかにした。
アミノ酸として、Val, Tyrを選択し、酵素としてthermolysin及びcarboxypeptidase Aを用いて、以下の合成条件で反応を実施した、5mM AA : enzyme/0.1M phos.buffer(pH5-8)-酢酸エチル(1:1),反応停止0.1%TFA。反応生成物の検出は逆相HPLC(5%-35%CH3CN/0.1%TFA)法により行った。その結果、
1)themolysinによるVY合成:pHの影響は顕著であり、pH44-6の範囲においてのみ合成が認められた。pH5.0,反応時間24h、5mM CaCl2存在下において、0.1%シュガーエステルの添加によって約3倍の合成量の増大が認められた(1352nM)。
2)50℃の条件で反応は促進され、合成速度は40pmol/ml/hと見積もられた。
3)Carboxypeptidase Aの場合においては、0.5%グリセロール添加によって反応は促進され、24時間の反応によって2936nmol/lの合成が認められた。
4)pH9.0,37℃、1.0%グリセロール添加の条件において、合成速度は、30nmol/ml/hと見積もられた。
以上の結果、両酵素を併用することによって、より高い合成収率を得ることが可能であると推察され、溶媒-水(海面活性剤添加)混合系が反応促進に有用であることが判明した。