ADAMTS4(aggrecanase-1)の軟骨組織内活性調節因子の網羅的探索

Research Project

Project/Area Number	15659362
Research Category	Grant-in-Aid for Exploratory Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Orthopaedic surgery
Research Institution	Keio University
Principal Investigator	岡田保典慶應義塾大学, 医学部, 教授 (00115221)
Project Period (FY)	2003 – 2004
Project Status	Completed (Fiscal Year 2004)
Budget Amount *help	¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000) Fiscal Year 2004: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000) Fiscal Year 2003: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
Keywords	ADAMTS4 / アグリカナーゼ / 細胞外マトリックス代謝 / フィブロネクチン / プロテオグリカン / 軟骨 / 分解 / プロテアーゼ
Research Abstract	軟骨プロテオグリカン(アグリカン)分解酵素であるADAMTS4(アグリカナーゼ-1)の結合タンパクをスクリーニングし、そのアグリカン分解活性を制御する分子を探索した。ADAMTS4のC末端部スペーサードメインは他のADAMTS分子と相同性がほとんどないことから、スペーサードメインをベイトにして酵母two hybrid systemによりヒト軟骨組織cDNAライブラリーをスクリーニングした。その結果、陽性を示したクローンの20%はフィブロネクチンであり、その結合はクロスリンカーを用いた実験で証明された。また、酵母two-hybrid assayとリコンビナントADAMTS4およびその欠失ミュータントを用いた結合アッセイの実験から、それぞれの分子のC末端部で結合することが明らかにされた。ADAMTS4を発現するトランスフェクタントでは、分泌されたADAMTS4は細胞膜表面でフィブロネクチンと共存することが共焦点顕微鏡で観察されたのに対し、スペーサードメインを欠失した分子では共存はみられなかった。ADAMTS4のアグリカナーゼ活性は、ADAMTS4をフィブロネクチンと予めインキュベートすると完全に阻害され、フィブロネクチンのC末端フラグメントとの結合でも同様な阻害が認められた。これらの結果は、フィブロネクチンがADAMTS4とそれぞれの分子のC末端同士の結合により、ADAMTS4のアグリカン分解活性を阻害することを初めて示しており、ADAMTS4の細胞膜表面での活性制御機構として重要と考えられる。現在、酵母two hybrid systemによりスクリーニングされたフィブロネクチン以外のタンパクに関して、結合実験と活性阻害実験を行った。