レンチウイルスベクターを用いたランダム遺伝子破壊による性染色体機能の解析

• Project/Area Number: 15681011
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Applied genomics
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 伊川 正人 大阪大学, 微生物病研究所, 助教授 (20304066)
• Project Period (FY): 2003 – 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥27,690,000 (Direct Cost: ¥21,300,000、Indirect Cost: ¥6,390,000); Fiscal Year 2005: ¥8,710,000 (Direct Cost: ¥6,700,000、Indirect Cost: ¥2,010,000); Fiscal Year 2004: ¥9,230,000 (Direct Cost: ¥7,100,000、Indirect Cost: ¥2,130,000); Fiscal Year 2003: ¥9,750,000 (Direct Cost: ¥7,500,000、Indirect Cost: ¥2,250,000)
• Keywords: レンチウイルスベクター / 遺伝子組換え動物 / 性染色体 / 遺伝子改変動物 / 遺伝子破壊 / cre / loxPシステム

Research Abstract

レンチウイルスベクターを受精卵に感染させれば、非常に効率良く多数の遺伝子座にGFP発現遺伝子を組み込むことができる。そのことを利用して、GFP遺伝子を性染色体に組み込むと同時に内在性遺伝子を破壊することにより、性染色体の遺伝子機能を解析することを目的として研究を進めてきた。
これまでに、酸性処理による透明帯除去ではなく、ガラスキャピラリーを用いて透明帯と卵の隙間にウイルスを注入するマイクロインジェクション法であれば、必要ウイルス量を減らせるだけでなく、卵へのダメージも少ないことを確認した。また破壊された遺伝子、つまりウイルスベクターが組み込まれた場所を、ランダムプライマーを用いたPCR法により決定する系を確立した。これまでに作製したトランスジェニックマウス系統について、150系統あまりの遺伝子導入部位を決定した。
さらにX性染色体にGFP発現カセットが組み込まれたトランスジェニックマウスを用いることで、雌雄の胚を着床前に選別し(X/X雌xX^<GFP>/Y雄の交配で得られる雌胚はすべてX/X^<GFP>、雄胚はすべてX/Yとなり、雌胚のみが緑色蛍光を発する)、雌雄における初期遺伝子発現の比較を行った。その結果、胚盤胞期ではY染色体からDbyおよびEif2s3yが、X染色体からはXistおよびRhox5が特異的に発現していることを明らかにした。さらに解析を進めRhox5がインプリント遺伝子であることを明らかにした。以上のことから、性染色体は着床前の早い時期から性分化の鍵を握っていることが推測された。

Research Products

• [Journal Article] Comparison of gene expression in male and female mouse blastocysts revealed imprinting of the x-linked gene, rhox5/pem, at preimplantation stages. (2006)
  • Author(s): Kobayashi S, (6), Ikawa M, (2), Okabe M.
  • Journal Title: Current Biology 16 Pages: 166-172
• [Journal Article] The immunoglobulin superfamily protein Izumo is required for sperm to fuse with eggs. (2005)
  • Author(s): Inoue N, Ikawa M, Isotani A, Okabe M.
  • Journal Title: Nature 434 Pages: 234-238
• [Journal Article] Distinct roles of IkappaB proteins in regulating constitutive NF-kappaB activity. (2005)
  • Author(s): Tergaonkar V, Correa RG, Ikawa M, Verma IM.
  • Journal Title: Nat Cell Biol 7 Pages: 921-923
• [Journal Article] レンチウイルスベクターを用いた遺伝子操作動物作製法 (2005)
  • Author(s): 伊川正人
  • Journal Title: 脳21 8 Pages: 86-90
• [Journal Article] Neuromedin U has a novel anorexigenic effect independent of the leptin signaling pathway (2004)
  • Author(s): Hanada R, (9), Ikawa M, (5), Kojima M.
  • Journal Title: Nat Med 10 Pages: 1067-1073
• [Journal Article] Lineage-specific cell disruption in living mice by Cre-mediated expression of diphtheria toxin A chain. (2004)
  • Author(s): Matsumura H, Hasuwa H, Inoue N, Ikawa M, Okabe M.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun 321 Pages: 75-79
• [Journal Article] The LIM homeobox gene, L3/Lhx8, is necessary for proper development of basal forebrain cholinergic neurons (2004)
  • Author(s): Mori T, (8), Ikawa M, Okabe M, Wanaka A.
  • Journal Title: Eur J Neurosci 19 Pages: 3129-3141
• [Journal Article] Selective passage through the uterotubal junction of sperm from a mixed population produced by chimeras of calmegin-knockout and wild-type male mice (2004)
  • Author(s): Nakanishi T, (2), Ikawa M, (2), Okabe M.
  • Journal Title: Biol Reprod. 71 Pages: 959-965
• [Journal Article] Identification of the XPG region that causes the onset of Cockayne syndrome by using Xpg mutant mice generated by the cDNA-mediated knock-in method (2004)
  • Author(s): Shiomi N, (4), Ikawa M, Okabe M, Shiomi T.
  • Journal Title: Mol Cell Biol 24 Pages: 3712-3719
• [Publications] Ikawa M, Tanaka N, Kao W, Verma I: "Generation of transgenic mice using lentiviral vectors : a nove preclinical assessment of lentiviral vectors for gene therapy"Mol Ther. 8(4). 666-673 (2003)
• [Publications] Tergaonkar V, Bottero V, Ikawa M, Li Q, Verma I: "IkappaB kinase-independent IkappaBalpha degradation pathway : functional NF-KappaB activity and implications for cancer thepray"Mol Cell Biol. 23(22). 8070-8083 (2003)
• [Publications] 伊川正人, 磯谷綾子, 岡部勝: "GFPマウスを用いたイメージング"Bioベンチャー. 3(6). 86-88 (2003)
• [Publications] Inoue N, Ikawa M, Nakanishi T, Matsumoto M, et al.: "Disruption of mouse CD46 causes an accelerated spontaneous acrosome reaction in sperm."Mol Cell Biol. 23(7). 2614-2622 (2003)
• [Publications] Kuramochi-Miyagawa S, Kimura T, Ijiri TW, Isobe T, et al.: "Mili, a mammalian member of piwi family gene, is essential for spermatogenesis."Development. 131(4). 839-849 (2004)