中枢神経細胞におけるCaM kinase kinaseの活性動態と機能

• Project/Area Number: 15700283
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Neurochemistry/Neuropharmacology
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 笠原 二郎 東北大学, 大学院・薬学研究科, 講師 (10295131)
• Project Period (FY): 2003 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000); Fiscal Year 2004: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000); Fiscal Year 2003: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
• Keywords: カルシウム / プロテインキナーゼ / ニューロン / 海馬 / 細胞内局在 / 活性 / カルモデュリン / リン酸化 / CaM kinase kinase / CaM kinaswe I / 活性測定 / 海馬神経細胞

Research Abstract

カルシウム/カルモデュリン(Ca/CaM)依存性プロテインキナーゼカスケードは、CaMKI,CaMKIVおよびそれらの活性化酵素であるCaMKKにより構成され、中枢神経では神経活動に伴った軸索伸展調節や遺伝子発現調節などに関与すると考えられる。CaMKKにはαとβの2つのアイソフォームが存在するが、その細胞内分布や機能に関する詳細な報告は少ない。私はラット培養海馬神経細胞を用いて、CaMKKαが細胞質と核の両方に、一方βは細胞質のみに存在していることを、(1)活性の測定、(2)免疫ブロット、(3)免疫染色、以上3つの手法により明らかにした。
(1)組み換えCaMKI変異体を作成し、これをCaMKK活性測定用基質とした。培養海馬神経細胞を破砕し、細胞質と核それぞれの抽出液を得、それぞれに含まれるCaMKKのCa依存性および非依存生活性を測定した。その結果、細胞質分画からはCa依存性および非依存性両方の活性が、核分画からはCa依存性活性のみが検出された。またそれぞれのCa依存性活性はグルタミン酸刺激により変化しなかったが、細胞質のCa非依存性活性は刺激により統計上有意な増加を示した。COS7細胞にCaMKKαおよびβアイソフォームをそれぞれ発現させて、その細胞抽出液中のCaMKK活性を測定したところ、CaMKKα発現細胞の抽出液にはCa依存性活性のみが、β発現細胞抽出液からはCa依存性及び非依存性両方の活性が検出された。
(2)上記(1)において得られたラット培養海馬神経細胞の細胞質及び核抽出液に対し、CaMKKα及びβのポリクローナル抗体を用いて免疫ブロットを行った。その結果、αは細胞質と核の両方より、またβは細胞質のみから免疫反応性が得られた。またグルタミン酸刺激によって、各分画におけるそれぞれの相対量は変化しなかった。
(3)メタノール固定した培養海馬神経細胞に対し、(2)で用いたポリクローナル抗体によって免疫染色を行った。CaMKKαの免疫反応性は細胞質と核の両方から、CaMKKβは細胞質のみから検出された。
(まとめ)以上の結果より、ラット培養海馬神経細胞において、Ca依存性活性のみを示すCaMKKαは細胞質と核の両方に、またCa依存性及び非依存性活性の両方を示すCaMKKβは細胞質にのみ存在することが示された。細胞質には主としてCaMKIが、核にはCaMKIVがそれぞれ存在することが報告されており、CaMKKアイソフォームの分布の相違は、活性化する下流の酵素の相違を生み出している可能性を示唆している。以上の結果の一部は現在、論文投稿準備中である。

Research Products

• [Journal Article] Cytoprotective effect of sodium orthovanadate on ischemia/reperfusion-induced injury in the rat heart involves Akt activation and inhibition of fodrin breakdown and apoptosis. (2004)
  • Author(s): Takada, Y., Hashimoto, M., Kasahara, J., Aihara, K., Fukunaga, K.
  • Journal Title: Journal of Pharmacological and Experimental Therapeutics 311(3) Pages: 1249-1255
• [Journal Article] Entrapment of migrating hippocampal neural cells in three-dimensional peptide nanofiber scaffold. (2004)
  • Author(s): Semino, CE., Kasahara, J., Hayashi, Y., Zhang, S.
  • Journal Title: Tissue Engineering 10 Pages: 643-655
• [Journal Article] Selective phosphorylation of nuclear CREB by fluoxetine is linked to activation of CaM kinase IV and MAP kinase cascades. (2004)
  • Author(s): Tiraboschi, E., Tardito, D., Kasahara, J., Moraschi, S., Pruneri, P., Gennarelli, M., Racagni, G., Popoli, M.
  • Journal Title: Neuropsychopharmacology 29 Pages: 1831-1840
• [Journal Article] Effect of lithium on the circadian rhythms of locomotor activity and GSK-3 protein expression in the mouse suprachiasmatic nuclei. (2004)
  • Author(s): Iwahana, E., Akiyama, M., Miyakawa, K., Uchida, A., Kasahara, J., Fukunaga, K., Hamada, T., Shibata, S.
  • Journal Title: European Journal of Neuroscience 19 Pages: 2281-2287
• [Journal Article] Expression and phosphorylation of δ-CaM Kinase II in cultured Alzheimer skin fibroblasts. (2004)
  • Author(s): Cavazzin, C., Bonvicini, C., Nocera, A., Racchi, M., Kasahara, J., Tardito, D., Gennarelli, M., Govoni, S., Racagni, G., Popoli, M.
  • Journal Title: Neurobiology of Aging 25(9) Pages: 1187-1196
• [Publications] Cavazzin, C., Bonvicini, C., Nocera, A., Racchi, M., Kasahara, J.et al.: "Expression and phosphorylation of δ-CaM kinase II in cultured Alzheimer fibroblasts."Neurobiology of Aging. In press. (2004)