人工塩基対の利用を目指したDNAポリメラーゼ変異体の作成と評価

• Project/Area Number: 15710164
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Living organism molecular science
• Research Institution: The University of Tokyo (2004); Kagoshima University (2003)
• Principal Investigator: 池田 修司 東京大学, 先端科学技術研究センター, 科学技術振興特任教員 (80336320)
• Project Period (FY): 2003 – 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥3,300,000 (Direct Cost: ¥3,300,000); Fiscal Year 2004: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2003: ¥2,700,000 (Direct Cost: ¥2,700,000)
• Keywords: 人工塩基 / イソグアニン / イソシトシン / 2-oxo(1H)pyridine / チオフェン / 温度感受性大腸菌 / polA12 / recA56 / recB23 / Thermus thermophilus / Thermus aquaticus / DNAポリメラーゼ / 非天然塩基

Research Abstract

人工塩基イソグアニンとイソシトシンに適したDNAポリメラーゼ変異体を作成する計画は継続中であるが、イソグアニンとイソシトシンはアメリカの研究室で開発されたものであり、日本発の技術とするためには、日本で開発された人工塩基対が必要である。そこで、東京大学先端科学技術研究センター平尾研究室がすでに開発していた2-oxo(1H)pyridine塩基を改良することをまず行った。具体的には、DNA中のウラシル塩基の5位にヘテロ環化合物を導入するとDNA-RNAハイブリッド2重らせんの熱力学的安定性が増加することが知られているので、人工塩基である2-oxo(1H)pyridineでも同様の効果が期待できると考え、ピリミジンの5位にあたる部分にチオフェンを導入したリボヌクレオシドを合成した。2-oxo(1H)pyridineを含むリボヌクレオシド(rY)をNISによりヨウ素化し、チオフェンのスズ化合物を用いたパラジウムカップリングにより5位にチオフェンを導入した。チアゾールの方がより安定になると考えられるが、パラジウムカップリングの収率が低いという問題があった。5位にチオフェンを導入したrYをDMTr化、アセチル化、そして脱DMTr化することにより2'と3'の水酸基がアセチル基で保護されたリボヌクレオシドを合成し、これをLudwig & Ecksteinらの方法で三リン酸の形へと変換した。またリボヌクレオシドをデオキシヌクレオシドへと変換した。