コーヒー含有二次代謝産物(ポリフェノール類)の生合成機構の解明

Research Project

Project/Area Number	15780076
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Applied biochemistry
Research Institution	Akita Prefectural University
Principal Investigator	水野幸一秋田県立大学, 生物資源科学部, 講師 (30302376)
Project Period (FY)	2003 – 2004
Project Status	Completed (Fiscal Year 2004)
Budget Amount *help	¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000) Fiscal Year 2004: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000) Fiscal Year 2003: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Keywords	カフェイン / コーヒー / ポリフェノール / cDNA / メチルトランスフェラーゼ
Research Abstract	コーヒーの果実を材料に、その登熟段階を追ってポリフェノールの生合成が活発な時期を特定する目的で、その増減と同調しているとの報告があるカフェイン生合成において、鍵酵素である最初のメチル化を司る7-メチルキサントシンシンターゼの遺伝子発現について詳しく調べた。開花日から開花後40日までの果実を採集し、全RNAを抽出し、7-メチルキサントシンシンターゼのcDNAをプローブとしたノーザンブロット分析を行なった結果、そのmRNA量は開花直後から急激に増加し、開花後5日目付近で最大となりその後は緩やかに減少していた。当初予想したように、果実の登熟初期から発現していたものの、開花後一週間以内の短い期間で最大となっていたことは驚きであった。これを指標として、カフェイン合成が最も盛んな時期と合成開始初期の果実、つまり開花後5日と開花日の果実からそれぞれ調製したRNAを用いてcDNA-AFLPを行い、発現量に差の見られる遺伝子群を網羅的に単離した。7-メチルキサントシンシンターゼと同様の発現パターンを示す候補遺伝子、つまり開花後急激に発現量が増大する遺伝子の配列を合計259個解析し、重複するものやartifactを除いて最終的に177遺伝子を単離することに成功した。得られたDNA断片について相同性検索を行い、既知遺伝子と相同性の見られたものが105個、相同性の見られない新規のものが72個であった。相同性の見られたもののうちポリフェノール類の合成に関与している可能性が推測される遺伝子断片数種類について、それらの配列情報をもとにRACE法等を用いて遺伝子の全長を得ている。