調節性細胞容積減少によるENaC細胞内局在制御の分子メカニズムの解析

Research Project

Project/Area Number	15790120
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	General physiology
Research Institution	Kyoto Prefectural University of Medicine
Principal Investigator	宮崎裕明京都府立医科大学, 医学研究科, 助手 (30360027)
Project Period (FY)	2003 – 2004
Project Status	Completed (Fiscal Year 2004)
Budget Amount *help	¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000) Fiscal Year 2004: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000) Fiscal Year 2003: ¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000)
Keywords	調節容積減少 / 細胞内Cl^-濃度 / A6細胞 / ENaC / GFP / MQAE / 調節性細胞容積減少 / 細胞内Cl濃度
Research Abstract	腎臓の遠位尿細管における上皮型Na^+チャネル(ENaC)を介したNa^+の再吸収は、体液量の恒常性維持に重要な働きを有し、血漿浸透圧によって厳密に制御されている。腎尿細管細胞においては、低浸透圧刺激がNa^+再吸収を促進するという報告がなされているが、ENaCの発現やトラフィッキング機構制御による、Na^+再吸収メカニズムはほとんど明らかにされていない。近年、低浸透圧刺激で惹起される調節性容積減少(RVD: Regulatory Vblume Decrease)により、細胞内Cl^-濃度が減少することが、Na^+再吸収の機能亢進に大きく影響している可能性が示唆されている。そこで本研究では、RVD惹起時の細胞内Cl^-濃度減少による、ENaC細胞内トラフィッキングを介した、Na^+再吸収制御機構の解明を目的とした。まず、Cell Analyzer QUANTAをもちいて、RVD惹起時におけるA6細胞の細胞内Cl^-濃度の変化を継時的に測定した。その結果、定常時約60mMでああった細胞内Cl^-濃度は、低浸透圧刺激後に惹起されたRVDによる細胞容積の減少とともに徐々に低下し、30分後には約10mMにまで減少し、細胞内Cl^-濃度の減少が、低浸透圧刺激の細胞内シグナルとして機能していることを明らかにした。また、Xenopus laevisのαENaC遺伝子配列をPCRで増幅した後、pEGFP発現ベクターに組み込み、αENaC+GFPの融合タンパク発現ベクターを作成した。ENaC+GFP発現ベクターを、LIPOFECTAMINE 2000試薬をもちいてA6細胞にtransfectした後、Geneticin耐性細胞をクローン化した。さらに、蛍光顕微鏡観察によりENaC+GFP安定発現株のスクリーニングを行い、ENaC細胞内トラフィッキング解析に用いる細胞株の確立を行った。