胃癌に特徴的なユビキチン化蛋白質の精製と同定

• Project/Area Number: 15790732
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Digestive surgery
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 薄葉 輝之 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (10317935)
• Project Period (FY): 2003 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2004: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2003: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: 胃癌 / ユビキチン / ユビキチン化蛋白質 / FK2抗体 / Western blotting / アフィニティークロマトグラフィー / モノユビキチン化ホスホグリセリン酸ムターゼB / PGM-B抗体 / ホスホグリセリン酸ムターゼB

Research Abstract

胃癌におけるユビキチン化蛋白質に関する研究を行った。手術検体15例分のヒト胃癌、および正常胃粘膜を採取し、採取後即座に-80℃にて凍結保存した。実験の際、これらを解凍した後プロテアーゼ阻害剤存在下でホモジネートし、遠心分離した上清にCDRを加え再度遠心分離、さらに超遠心分離した上清を水溶性画分として抽出した。これら水溶性画分の他に尿素を用いた難溶性画分も作成した。以上から、癌組織、正常組織および水溶性画分、難溶性画分の合計60種類の実験材料を作成した。これらの材料を各々、当施設で開発したERISAを用いた定量法によりユビキチン化蛋白質を定量し比較検討したところ、正常組織に比べ有意に癌組織におけるユビキチン化蛋白質は多かった。次に、予備実験としてこれら60種類を抗ユビキチン抗体であるFK2を用いたWestern blottingで分析し、癌と正常組織で差のあるユビキチン化蛋白質を探索した結果、癌で特徴的な数個のバンドが認められた。この中から48KDaのバンドに注目して、FK2抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、ユビキチン化蛋白質を精製マルチユビキチン化蛋白質を分離した。精製された同蛋白質を限定分解酵素で消化し、ユビキチン化タグペプチドに対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで標的蛋白質由来のペプチド断片のみを精製した後、このペプチド混合標品を逆相HPLCで分離し、精製ペプチドのアミノ酸配列をプロテインシーケンサーを用いて解析中である。また、一方、大腸癌で特徴的なユビキチン化蛋白質と同定されたモノユビキチン化ホスホグリセリン酸ムターゼBが胃癌においても認められるかを検討する目的でホスホグリセリン酸ムターゼB(PGM-B)抗体を用いたWestern blottingを施行したところ、癌と正常組織で有意に差のあるバンドが認められ、胃癌においてもモノユビキチン化ホスホグリセリン酸ムターゼBが蓄積する可能性が示唆された。