Aeromonas属細菌感染症における重症化機序の解明

• Project/Area Number: 15791032
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Emergency medicine
• Research Institution: University of Miyazaki (2004); 宮崎医科大学 (2003)
• Principal Investigator: 松岡 博史 宮崎大学, 医学部, 助手 (30315379)
• Project Period (FY): 2003 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000); Fiscal Year 2004: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000); Fiscal Year 2003: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
• Keywords: Aeromonas属細菌 / 壊死性筋膜炎 / ヒアルロニダーゼ

Research Abstract

平成15年度に引き続き、ヒアルロニダーゼ(HAase)の分離・精製を行った。
スクリーニング(Smith and Willettの方法)の結果、20株中3株がHAase陽性であった。陽性の3株はいずれも死亡例から分離されたものであった。この中の1株(KYO23株)の培養上清中に多量のHAaseが存在することが明らかになったため、本菌株からのHAase精製を試みた。
培養上清の60%硫安沈殿画分を出発材料とし、Phenyl Sepharose HPカラムを用いた疎水クロマトグラフィーおよびMonoQカラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離精製を行った。MonoQ活性画分のSDS-PAGE解析では、60kDaのメジャーバンドと複数の微量タンパクが存在し、ザイモグラフィによる解析では、60kDaのメジャーバンドに一致してHAaseの活性が認められた。このメジャーバンドをPVDF膜にブロッティングし、N末端配列の解析を行った結果、LTTEYKILADの配列を得た。
このメジャーバンドの内部アミノ酸配列を得るためにprotenaseKを用いて限定分解したが、うまく分解できなかった。細菌より分泌される蛋白であり、ある種の蛋白分解酵素に抵抗性を有すると考えられた。そこで、臭化シアンを用いて分解を試みた。臭化シアンによりメジャーバンドはさらに4つのバンドに分かれることが確認された。これをPVDF膜にブロッティングし、内部配列のN末端解析を行ったが、充分な配列は得られなかった。その原因として不純物の混入が考えられたため、シアン分解した資料をさらに逆相クロマトグラフィーにより分離し、それぞれにN末端解析を行うこととし現在検索中である。