DNAポリメラーゼ研究におけるゲノム科学的，分子科学的アプローチの融合
| Project/Area Number |
15H06032
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Molecular biology
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
大学 保一 東北大学, 学際科学フロンティア研究所, 助教 (80619875)
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| Project Period (FY) |
2015-08-28 – 2016-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2015)
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| Budget Amount *help |
¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2015: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | DNA複製 / 突然変異 / ＤＮＡポリメラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
＜Polζゲノム科学的解析に必要な分裂酵母株の作成＞
リボヌクレオチドを高頻度の取り込むPolζをコードする変異遺伝子の作成に着手した．第一に，Polε，PolδとPolζのカタリティックドメインのアライメントを作成し，Polζの変異されるべきアミノ酸を特定した．その後，Polζをコードする遺伝子（rev3）をプラスミドにクローニング後，当該アミノ酸が変異した遺伝子を作成した．その遺伝子をcre-loxシステムを用いて，分裂酵母の内在のrev3遺伝子と置換した．この酵母を使用して，細胞内での変異Polζの機能を解析した結果，多少の機能低下は観察されるものの，PolζのＤＮＡ合成能は失われていないことが判明した．現在，変異PolζのＤＮＡ合成によるリボヌクレオチドの取り込み定量を行っている．今後は，この株を利用して，ゲノムワイドにPolζ合成領域の特定（Pu-seq）を行う．変異Polζ遺伝子をコードする酵母株の作成と並行して，PolζによるＤＮＡ合成が必要となる細胞株の樹立もおこなった．Polζ欠損株とPolεの機能が低減した株をかけ合せて結果，PolεとPolζの二重変異株において顕著な増殖阻害が観察された．これは，Polε変異体でゲノム中のPolζの合成領域が拡大していることを示している．よって，Polε変異体において，Polζを対象としたPu-seq実験を行い，Polζがリーディング鎖合成を担うPolεを補助する仕組みを今後検証する．
＜細胞内でのPolζの１分子レベルでの観察に必要な酵母株の作成＞
PALM法を用いて，Polζの細胞内１分子観察を行うため，Polζのカタリティック因子のN末端にｍEos蛍光体が結合した遺伝子の作成に着手した．現在までに，Polζ遺伝子とｍEos遺伝子が結合した配列のプラスミド上へのクローニングが完了し，現在，酵母株への導入を行っている．
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| Research Progress Status |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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Report
(1 results)
Research Products
(4 results)
