| Project/Area Number |
15J05262
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Research Field |
Molecular biology
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
宮﨑 亮次 京都大学, 理学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2017-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2016)
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| Budget Amount *help |
¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Fiscal Year 2016: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2015: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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| Keywords | 熱ショック転写因子σ32 / 部位特異的in vivo光架橋法 / シグナル認識粒子 / 部位特異的in vivo光架橋実験 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
熱ショック転写因子σ32制御には、SRPや分子シャペロンDnaK/DnaJ等の複数の因子が関与するが、それら因子がどのように関連を持って働くのかは不明である。それを明らかにするために、σ32制御過程の「中間体」を蓄積すると考えられるσ32制御に関わる因子の変異株で、in vivo光架橋解析を行うことによって、σ32とその制御因子の相互作用がどのように変化するかを解析した。そして、σ32制御に関わるSRP受容体FtsYの変異等によって、σ32とSRPタンパク質Ffhの相互作用がわずかに変化することを見出した。しかし、これらの因子の直接的な影響か、細胞とって重要な因子が不全となることによる間接的な影響かを判断することは困難であった。そこで、σ32の合成から分解に至るまでの各細胞因子との相互作用を経時的に観察するために、部位特異的in vivo光架橋法を応用した細胞内でのタンパク質間相互作用のダイナミクスを解析可能な実験系の開発を行った。
まず、架橋形成に必要なUV照射時間を従来の数分から1秒程度に、大幅に短縮できる条件を見出した。そして、光架橋実験とパルス・チェイス実験を組み合わせることで、タンパク質の合成からタンパク質複合体を形成する成熟過程を解析できるかを調べた。その実証のために、成熟過程が良く研究された３種の異なるタンパク質をモデル基質として用い、構築した実験系の妥当性・応用性を検証した。その結果、この手法では親水性タンパク質だけでなく膜タンパク質でも解析ができ、また、タンパク質の生合成中間体の折りたたみ状態やタンパク質間相互作用を解析できることを実証した。この手法を用いて、σ32の合成後の挙動を予備的に解析したところ、RNAポリメラーゼと相互作用後、その相互作用は低下し、徐々に分子シャペロン等の制御因子との操作用をするとともに、量が減少していく様子を観察できた。
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| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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