タンパク質の折り畳み機構の実験的解明 高速溶液混合と低温実験の一分子観測への応用

• Project/Area Number: 15J05654
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Physical chemistry
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 齊藤 雅嵩 東北大学, 理学研究科, 特別研究員(DC2)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2017-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000); Fiscal Year 2016: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2015: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: 一分子蛍光分光測定 / 折り畳み / FRET / ライン型共焦点顕微鏡 / タンパク質の吸着 / タンパク質の折り畳み

Outline of Annual Research Achievements

タンパク質の変性状態を詳細に研究するために、研究室独自のライン型共焦点顕微鏡を用いて、蛍光色素標識されたユビキチンの一分子蛍光分光測定を行った。タンパク質の変性状態の特性を調べることは、タンパク質の折り畳みと凝集を理解するために重要である。しかし、変性タンパク質の構造、不均一性、ダイナミクスについて、未だに多数の議論が継続している。そこで本研究では、変性状態のタンパク質について、一分子蛍光分光計測を行うことで、その特性を調べた。蛍光色素間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)を一分子観測することで、変性したタンパク質の構造変化を捉えた。本研究結果から、ユビキチンの変性状態における構造の不均一性と遅いダイナミクスを明らかになった。
タンパク質の一分子測定において、測定に用いる流路表面への試料の吸着が再現性を大きく低下させることがある。本研究では、生体適合性ポリマーとして知られるMPCコポリマーをサンプル送液系の流路表面に共有結合させて親水化することで、試料の吸着を大きく低減させ、さらに、吸着に起因するデータの再現性の低下問題を解決した。タンパク質の折り畳み研究のモデルタンパク質として使われているユビキチンに2色の蛍光色素を標識し、一分子蛍光分光計測を行った。一分子測定の結果、変性状態のユビキチンは不均一な構造の間をミリ秒程度の遅い時定数で遷移することが示唆された。このことは、変性状態のユビキチンは不均一な構造を持ち、ミリ秒以上のゆっくりした時間スケールで異なる構造間の遷移を起こしていることを示している。これらの結果は、論文としてまとめ、journal of physical chemistry Bに投稿した。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Academia Sinica(台湾)
• [Journal Article] Significant Heterogeneity and Slow Dynamics of the Unfolded Ubiquitin Detected by the Line Confocal Method of Single-Molecule Fluorescence Spectroscopy (2016)
  • Author(s): Masataka Saito, Supawich Kamonprasertsuk, Satomi Suzuki, Kei Nanatani, Hiroyuki Oikawa, Keiichiro Kushiro, Madoka Takai, Po-ting Chen, Eric H.-L. Chen, Rita P.-Y. Chen, Satoshi Takahashi
  • Journal Title: J. Phys. Chem. B Volume: 120 Issue: 34 Pages: 8818-8829
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.6b05481
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] Significant heterogeneity and slow transition of the denatured ubiquitin detected by single-molecule fluorescence spectroscopy (2016)
  • Author(s): Saito, M.; Oikawa, H.; Kushiro, K.; Takai, M.; Chen, P.-T.; Chen, E. H.-L.; Chen, R. P.-Y.; Takahashi, S.
  • Organizer: 日本生物物理学会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場（茨城県つくば市）
  • Year and Date: 2016-11-25
• [Presentation] :Significant heterogeneity and slow transition of the denatured ubiquitin detected by single molecule fluorescence spectroscopy. (2016)
  • Author(s): Saito, M.; Oikawa, H.; Kushiro, K.; Takai, M.; Chen, P.-T.; Chen, E. H.-L.; Chen, R. P.-Y.; Takahashi, S.
  • Organizer: The Third International Symposium on Protein Folding and Dynamics
  • Place of Presentation: National Centre for Biological Sciences （バンガロール、インド）
  • Year and Date: 2016-11-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ユビキチンの折り畳みダイナミクスの一分子蛍光分光測定 (2015)
  • Author(s): 齊藤雅嵩, Chen Eric H.-L., Chen Po-Ting, Chen Rita P.-Y., 鎌形清人, 小井川浩之, 高橋聡
  • Organizer: 第９回分子科学討論会
  • Place of Presentation: 東京（東京工業大学大岡山キャンパス）
  • Year and Date: 2015-09-16
• [Presentation] 一分子蛍光分光法によって観測されたユビキチンの変性状態の不均一性 (2015)
  • Author(s): 齊藤雅嵩, Chen Eric H.-L., Chen Po-Ting, Chen Rita P.-Y., 鎌形清人, 小井川浩之, 高橋聡
  • Organizer: 第53回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 石川県金沢市（金沢大学角間キャンパス）
  • Year and Date: 2015-09-13