ゼニゴケｍｉｃｒｏＲＮＡの欠失変異体の作出および形態制御メカニズムの解明

• Project/Area Number: 15J08774
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Plant molecular biology/Plant physiology
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 都筑 正行 東京大学, 総合文化研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2017-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000); Fiscal Year 2016: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2015: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: microRNA / ゼニゴケ / 発生

Outline of Annual Research Achievements

平成28年度は、前年度作出したゼニゴケmicroRNA（miRNA）変異株の解析を主に行った。CRISPR/Cas9を用いてMIRNA遺伝子座を標的として作出したmirna変異株の1つは、本来栄養成長を続ける葉状体が生殖器様に形態が変化していた。雌雄個体ともに生殖器様の形態を示したことから、このmiRNAは雌雄決定因子ではなく、栄養成長期から生殖成長期への相転換を通常時抑制していることが推測される。詳細に表現型を解析するため、変異体の走査型電子顕微鏡を用いた観察および切片観察を行なった結果、雄株の葉状体は精子を形成し、雌株の葉状体には造卵器が形成されていた。以上の結果から、このmiRNAはゼニゴケの栄養成長期から生殖成長期への相転換抑制因子であることが強く示唆された。
miRNAは相補的な配列を持つmRNAに結合することで、標的遺伝子の発現を抑制するはたらきを持つ。そこで次に、表現型の原因となる標的遺伝子を同定することにした。前年度の研究により、プログラムによって塩基配列の相補性を元に行なったmiRNAの標的遺伝子予測、およびRACE方を用いた標的mRNAの切断部位同定の結果から、標的遺伝子としてすでに予測されていた遺伝子をRT-qPCR法によって定量し、変異株においてmRNAの蓄積量が増大していることがわかった。次にmiRNAと相補度合いの高い結合配列を、アミノ酸配列が変化しないよう同義置換した遺伝子配列をクローニングし、ベクターを用いて野生型植物体に遺伝子導入した形質転換体を作出した。miRNA耐性遺伝子の形質転換植物体は、雌雄ともにmirna変異株と同様に葉状体が生殖器官様に分化する表現型を示したことから、mirna変異体の表現型は、標的遺伝子の転写後発現抑制の欠損が原因であるということが強く示唆された。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Monash University(オーストラリア)
• [Journal Article] Profiling New Small RNA Sequences (2017)
  • Author(s): Masayuki Tsuzuki, Yuichiro Watanabe
  • Journal Title: Methods in Molecular Biology Volume: 1456 Pages: 177-188
  • DOI: 10.1007/978-1-4899-7708-3_14
  • ISBN: 9781489977069, 9781489977083
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Interconnections between mRNA degradation and RDR-dependent siRNA production in mRNA turnover in plants (2017)
  • Author(s): Masayuki Tsuzuki, Kazuki Motomura, Naoyoshi Kumakura, Atsushi Takeda
  • Journal Title: Journal of Plant Research Volume: 130 Issue: 2 Pages: 211-226
  • DOI: 10.1007/s10265-017-0906-8
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Profiling and Characterization of Small RNAs in the Liverwort, Marchantia polymorpha, Belonging to the First Diverged Land Plants (2016)
  • Author(s): Masayuki Tsuzuki, Ryuichi Nishihama, Kimitsune Ishizaki, Yukio Kurihara, Minami Matsui, John L. Bowman, Takayuki Kohchi, Takahiro Hamada, and Yuichiro Watanabe
  • Journal Title: Plant and Cell Physiology Volume: 57(2) Issue: 2 Pages: 359-372
  • DOI: 10.1093/pcp/pcv182
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 陸上植物に保存された microRNA による発生制御機構 (2016)
  • Author(s): 都筑正行、濱田隆宏、渡邊雄一郎
  • Organizer: 日本植物学会第80回大会
  • Place of Presentation: 沖縄コンベンションセンター（沖縄県宜野湾市）
  • Year and Date: 2016-09-16
• [Presentation] Profiling and characterization of microRNAs in the liverwort, Marchantia polymorpha (2016)
  • Author(s): Masayuki Tsuzuki
  • Organizer: OddPols 2016
  • Place of Presentation: University of Michigan（米国ミシガン州）
  • Year and Date: 2016-06-24
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Profiling and characterization of small RNAs in the liverwort, Marchantia polymorpha (2016)
  • Author(s): 都筑正行、西浜竜一、石崎公庸、栗原志夫、松井南、John L. Bowman、河内孝之、濱田隆宏、渡邊雄一郎
  • Organizer: 第57回日本植物生理学会年会
  • Place of Presentation: 岩手大学上田キャンパス（岩手県盛岡市）
  • Year and Date: 2016-03-18
• [Presentation] タイ類ゼニゴケにおけるmicroRNAの機能解析 (2016)
  • Author(s): 都筑正行、西浜竜一、石崎公庸、栗原志夫、松井南、John L. Bowman、河内孝之、濱田隆宏、渡邊雄一郎
  • Organizer: 第5回植物RNAワークショップ
  • Place of Presentation: 東京大学駒場キャンパス（東京都目黒区）
  • Year and Date: 2016-01-08
• [Presentation] Characterization of small RNAs in a liverwort, Marchantia polymorpha (2015)
  • Author(s): Masayuki Tsuzuki, Tsuyoshi Fujimoto, Ryuichi Nishihama, Kimitsune Ishizaki, Yukio Kurihara, Minami Matsui, Takayuki Kohchi, Takahiro Hamada, Yuichiro Watanabe
  • Organizer: EMBL Symposium “The Non-Coding Genome”
  • Place of Presentation: ハイデルベルク（ドイツ）
  • Year and Date: 2015-10-18
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 苔類ゼニゴケにおけるmicroRNAの機能解析 (2015)
  • Author(s): 都筑正行、藤本剛史、西浜竜一、石崎公庸、栗原志夫、松井南、河内孝之、濱田隆宏、渡邊雄一郎
  • Organizer: 日本植物学会第79回大会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ（新潟県新潟市）
  • Year and Date: 2015-09-16
• [Presentation] 苔類ゼニゴケにおけるmicroRNAの機能解析 (2015)
  • Author(s): 都筑正行、藤本剛史、西浜竜一、石崎公庸、栗原志夫、松井南、河内孝之、濱田隆宏、渡邊雄一郎
  • Organizer: 第4回植物RNAワークショップ
  • Place of Presentation: ホテルライフォート札幌（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-07-15
• [Book] ノンコーディングRNA (2016)
  • Author(s): 都筑正行、濱田隆宏、佐藤豊
  • Total Pages: 372
  • Publisher: 化学同人
• [Remarks] 渡邊雄一郎研究室ホームページ 業績一覧
  • URL: http://park.itc.u-tokyo.ac.jp/RNAwatanabe/achievements.html