1分子蛍光観察用の究極感度カメラ開発による細胞膜ナノドメインの機能の解明

• Project/Area Number: 16201025
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: Nanomaterials/Nanobioscience
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 楠見 明弘 Kyoto University, 再生医科学研究所, 教授 (50169992)
• Project Period (FY): 2004 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2006)
• Budget Amount: ¥50,570,000 (Direct Cost: ¥38,900,000、Indirect Cost: ¥11,670,000); Fiscal Year 2006: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000); Fiscal Year 2005: ¥17,810,000 (Direct Cost: ¥13,700,000、Indirect Cost: ¥4,110,000); Fiscal Year 2004: ¥26,650,000 (Direct Cost: ¥20,500,000、Indirect Cost: ¥6,150,000)
• Keywords: 1分子観察 / 1分子ナノバイオロジー / ナノドメイン / 細胞膜 / 蛍光顕微鏡 / 高感度カメラシステム / ラフトドメイン / シグナル変換 / 冷却インテンシファイヤー / 3段MCP / シグナルの量子化 / ナノラフト / 1分子蛍光追跡 / 生細胞 / 時間分解能

Research Abstract

本研究の目的は、(1)まず、生細胞中で、1蛍光分子追跡をするための、高感度のカメラシステムを開発すること、(2)次に、このカメラシステムを用いて、ナノラフトの生成機構、及び、構造-機能相関の解明を進めることであった。
(1)の高感度のカメラシステムの開発については、本研究期間中に、高感度の3段MCP型イメージインテンシファイアー(像倍率 最大〜107倍)を高速CMOSセンサーに光ファイバーカップルしたカメラを作製した(この部分は、株式会社フォトロンのご協力による)。
(2)については、本研究期間中に、下記のことが明らかになった。
1)ナノラフトの可塑性についての検討を進めた結果、細胞外からのシグナルによって、より大きく安定なラフトが誘起されることが分かった。
2)ラフトの脂質鎖による、表側ラフトと裏側ラフトのカップリングを検討した結果、細胞膜外層に安定化ラフトができること、内層にも安定化ラフトが誘導される可能性が示唆された。
3)細胞外からシグナルが来る前の細胞膜では、ラフトはあったとしても非常に小さく、不安定であることが示された。
4)グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型受容体(GPI-ARs)へのシグナル入力とそれがどのように細胞内に伝達されるがを調べた結果、リガンド結合によって、GPI-ARsは会合し、それが、会合部分へのコレステロールと糖脂質の濃縮とを誘起して、その部分に、会合体と同じ程度の大きさのやや安定なナノラフトが形成されること、さらに、このGPI-ARクラスターナノラフトに細胞内のラフト関連シグナル分子、GαiやSrc-family-kinase分子がリクルートされ、そこでこれらの分子が結合することによって、Src-family-kinaseが活性化されることが示された。

Research Products

• [Journal Article] Effects of pH-induced variations of the charge of the transmembrane α-helical peptide ac-k2(la)12k2-amide on the organization and dynamics of the host dimyristoylphosphatidylcholine bilayer membrane (2006)
  • Author(s): W.K.Subczynski
  • Journal Title: Biochim.Biophys.Acta-Biomembranes 1720 Pages: 99-109
• [Journal Article] Three-dimensional reconstruction of the membrane skeleton at the plasma membrane interface by electron tomography (2006)
  • Author(s): N.Morone
  • Journal Title: J.Cell Biol. 174・6 Pages: 851-862
• [Journal Article] Three-dimensional dynamic structure of the liquid-ordered domain in lipid membranes as examined by pulse-EPR oxygen probing (2006)
  • Author(s): W.K.Subczynski
  • Journal Title: Biophysical Journal 92・5 Pages: 1573-1584
• [Journal Article] Three-dimensional reconstruction of the membrane skeleton at the plasma membrane interface by electron tomography (2006)
  • Author(s): N.Morone, T.Fujiwara, K.Murase, R.S.Kasai, H.Ike, S.Yuasa, J.Usukura, A.Kusumi
  • Journal Title: J. Cell Biol. 174・6 Pages: 851-862
• [Journal Article] Three-dimensional dynamic structure of the liquid-ordered domain in lipid membranes as examined by pulse-EPR oxygen probing (2006)
  • Author(s): WK.Subczynski, A.Wisniewska, JS.Hyde, A.Kusumi
  • Journal Title: Biophys. J. 92・5 Pages: 1573-1584
• [Journal Article] Detection of non-Brownian diffusion in the cell membrane in single molecule tracking (2005)
  • Author(s): K.Ritchie
  • Journal Title: Biophysical Journal 88 Pages: 2266-2277
• [Journal Article] Fluorescence imaging for monitoring the colocalization of two single molecules in living cells (2005)
  • Author(s): I.Koyama-Honda
  • Journal Title: Biophysical Journal 88 Pages: 2126-2136
• [Journal Article] Rapid hop diffusion of a G-protein-coupled receptor in the plasma membrane as revealed by single-molecule techniques (2005)
  • Author(s): K.Suzuki
  • Journal Title: Biophysical Journal 88 Pages: 3659-3680
• [Journal Article] Detection of non-Brownian diffusion inthe cell membrane in single molecule tracking (2005)
  • Author(s): K.Ritchie, †X.-Y.Shan, J.Kondo, K.Iwasawa, T.Fujiwara, A.Kusumi
  • Journal Title: Biophysical Journal 88 Pages: 2266-2277
• [Journal Article] Fluorescence imaging for monitoring the colocalization of two single molecules in living cells (2005)
  • Author(s): I.Koyama-Honda, †K.Ritchie, T.Fujiwara, †R.Iino, †H.Murakoshi, R.S.Kasai, A.Kusumi
  • Journal Title: Biophysical Journal 88 Pages: 2126-2136
• [Journal Article] Rapid hop diffusion of a G-protein-coupled receptor in the plasma membrane as revealed by singles-molecule technique (2005)
  • Author(s): K.Suzuki, †K.Ritchier, †E.Kajikawa, T.Fujiwara, A.Kusumi
  • Journal Title: Biophysical Journal 88 Pages: 3659-3680
• [Journal Article] Detection of non-Brownian diffusion in the cell membrane in single molecule tracking (2005)
  • Author(s): K.Ritchie
  • Journal Title: Biophys. J. 88・3 Pages: 2266-2277
• [Journal Article] Fluorescence imaging for monitoring the colocalization of two single molecules in living cells (2005)
  • Author(s): I.Koyama-Honda
  • Journal Title: Biophys. J. 88・3 Pages: 2126-2136
• [Journal Article] Rapid hop diffusion of a G-protein-coupled receptor in the plasma membrane as revealed by single-molecule techniques (2005)
  • Author(s): K.Suzuki
  • Journal Title: Biophys. J. 88(印刷中)
• [Journal Article] Single-molecule imaging analysis of Ras activation in living cells (2004)
  • Author(s): H.Murakoshi
  • Journal Title: Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 101・19 Pages: 7317-7322
• [Journal Article] Ultrafine membrane compartments for molecular diffusion as revealed by single molecule techniques (2004)
  • Author(s): K.Murase
  • Journal Title: Biophysical Journal 86・6 Pages: 4075-4093
• [Journal Article] Effects of phospholipid unsaturation on the bilayer nonpolar region:a molecular simulation study (2004)
  • Author(s): T.Rog
  • Journal Title: J.Lipid Res. 45 Pages: 326-336
• [Journal Article] Single-molecule imaging analysis of Ras activation in living cells (2004)
  • Author(s): H.Murakoshi
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101・19 Pages: 7317-7322
• [Journal Article] Ultrafine membrane compartments for molecular diffusion as revealed by single molecule techniques (2004)
  • Author(s): K.Murase
  • Journal Title: Biophys. J. 86・6 Pages: 4075-4093
• [Journal Article] Molecular dynamics and interactions for creation of signal-induced stabilized rafts from small unstable steady-state rafts (2004)
  • Author(s): A.Kusumi
  • Journal Title: Traffic 5 Pages: 213-230