蝸牛求心性聴覚情報伝達機構における一酸化窒素の作用及び細胞内Ca^<2+>動態への影響
Project/Area Number |
16791028
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Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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Allocation Type | Single-year Grants |
Research Field |
Otorhinolaryngology
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Research Institution | Kansai Medical University |
Principal Investigator |
永田 基樹 関西医科大学, 医学部, 助手 (10340712)
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Project Period (FY) |
2004 – 2005
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Project Status |
Completed (Fiscal Year 2005)
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Budget Amount *help |
¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000)
Fiscal Year 2005: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
Fiscal Year 2004: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
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Keywords | 蝸牛 / 内有毛細胞 / 外有毛細胞 / 一酸化窒素 / Ca2+ / feedback / p2 receptor / inner hair cell / nitric oxide / neuronal nitric oxide synthase / auditory neurotransmission / Ca^<2+> influx / cochlea / ATP |
Research Abstract |
本研究では単離したモルモットの内有毛細胞を用い、NOのATP刺激により細胞内Ca^<2+>上昇に対する抑制作用のメカニズムを調べ、更に求心性の内有毛細胞内カルシウムへのnegative feedback作用に関わるNOの産生酵素を同定し、内耳求心性聴覚情報伝達機構におけるNO作用の解明を目的にしている。DAF-2を用いた実験で、ATP刺激によって、内有毛細胞において経時的なDAF-2の蛍光強度の増加すなわちNOの産生が見られた。このNO産生は非特異的NOS阻害剤であるL-NAME及びP2 receptorのantagonistであるsuramin, calmodulinのantagonistであるcalmidazoliumによって抑制された。Ca^<2+>-freeの場合はATP刺激によるNOの産生が認められなかった。NOとCa^<2+>同時測定の実験で、ATP刺激によって、内有毛細胞の細胞内Ca^<2+>濃度上昇後にNO産生が観察された。Fura-2を用いた実験で、ATP刺激による内有毛細胞内Ca^<2+>濃度の上昇はL-NAMEによって増強されたが、NO donorであるSNAPによって抑制された。更にATPによるCa^<2+>反応は膜透過型cGMPである8-Br-cGMPに抑制されたが、NOの標的酵素soluble guanylyl cyclase(sGC)の抑制剤であるODQ及びcGMP-依存性protein kinase(PKG)の抑制剤であるKT5823によって増強された。また、選択的nNOSの阻害剤である7-NIは非特異的NOS阻害剤であるL-NAMEと同程度にATP刺激によるNOの産生を抑制し、同程度にATP刺激によるCa^<2+>反応を増加した。単離した内有毛細胞を持ち、nNOSとeNOS、ATPのreceptorであるP2x2とnNOSとの二重免疫蛍光染色を行い、その結果、nNOSは細胞内に均一分布したeNOSと違って、内有毛細胞の頂部(apical region)に強く存在し、それにnNOSとP2X2は内有毛細胞の頂部に共存した。それぞれの免疫反応の特異性は蝸牛組織の蛋白抽出物を用い、western blotで確認した。以上の事から、ATPによるNOの産生は、P2 receptorの活性化によりCa^<2+>の流入がおこり、結果細胞内Ca^<2+>濃度が上昇し、nNOSが活性化され、NO産生が惹起された。惹起されたNOは、NO/cGMP/PKG経路を介して、negative feedbackにATPによるCa^<2+>の細胞内への流入を抑制したと考えられた。
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Report
(2 results)
Research Products
(2 results)