O-マンノース型糖鎖生合成経路の解明

• Project/Area Number: 16K08262
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: Biological pharmacy
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology
• Principal Investigator: 遠藤 玉夫 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 所長代理 (30168827)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2018: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2017: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2016: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
• Keywords: 糖鎖 / O-マンノース / 筋ジストロフィー / 糖転移酵素

Outline of Annual Research Achievements

α-ジストログリカノパチー(α-DGpathy)は筋異常に加え中枢神経系の異常を伴う最重症タイプの先天性筋ジストロフィー症の一群で、α-ジストログリカン(α-DG)のO-マンノース（Man）型糖鎖不全を原因とする。病態の中心はα-DGと細胞外マトリックス分子との結合障害であり、この結合はグルクロン酸（GlcA）とキシロース（Xyl）からなる繰り返し構造（GlcA-Xylリピート）を介している。GlcA-XylリピートはO-Man型糖鎖のコアM3構造に2個のリビトール5リン酸（RboP）を介して結合しており、α-DGpathyの原因遺伝子fukutin、FKRPによって合成される。
今年度は、2番目のRboP転移酵素であるFKRPの結晶構造の解明と内在性のfukutinとFKRPによる複合体の形成の有無の確認を行った。結晶構造解析から、FKRPのゴルジ内腔側ドメインはN末側からステムドメインと触媒ドメインに分けられ、ステムドメインを介して多量体を形成していることが示唆された。そこで、ゲル濾過クロマトグラフィーで分子量を調べたところ、FKRPは溶液中で多量体を形成していることが確認された。一方、疾患FKRP変異体（Y88F, S221R）は、低分子量画分に検出され、多量体が形成されないことが分かった。また、TMEM5のみを強制発現させた細胞からTMEM5を免疫沈降した画分に、fukutin活性とFKRP活性がともに検出された。これにより内在性のfukutinおよびFKRPとTMEM5は複合体を形成していることが明らかになった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、FKRPの結晶構造を解明し多量体を形成することを明らかにした。FKRPのステムドメインは多量体形成に関与しており、疾患変異体の性状から多量体構造が機能に重要であることが示唆された。
また、TMEM5は内在性のfukutinおよびFKRPと複合体を形成することを明らかにした。これまで、RboPを含むO-Man型糖鎖は、α-DGのみでしか検出されないことから、RboPを含むO-Man型糖鎖修飾の標的となるタンパク質はかなり限定的であると考えられる。fukutin、FKRP、TMEM5は[Xylβ1-4RboP-1RboP-3]を合成する連続した反応を担うことから、複合体の形成は、希少な標的に確実にかつ効率的に糖鎖を合成することに寄与していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

我々の研究により、O-Man型糖鎖の完全な構造とα-DGpathyの原因遺伝子産物の多くが糖転移酵素であることが明らかになってきた。そこで、これらの糖転移酵素の詳細な機能や病態との関係を明らかにする必要がある。
次年度は、以下の実験を計画している。
（1）タンパク質上のO-Manに対してPOMGnT2は小胞体でコアM3を合成し、POMGnT1はゴルジ体でコアM1を合成することから、POMGnT2によるコアM3形成に優先性がある。現在、POMGnT1の結晶構造解析が終了しており、POMGnT2の構造解析を進めている。この結晶構造解析に様々な配列のペプチドを用いており、POMGnT1とPOMGnT2の基質特異性が明らかになることが期待される。
(2) FukutinやFKRPは哺乳類では初めて見つかったRboP転移酵素であるため、X線構造解析によりFukutinやFKRPの構造を詳細に解析し、RboP転移のメカニズムと患者変異によるα-DGpathy発症のメカニズムを検討する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Baylor College of Medicine(USA)
• [Int'l Joint Research] Peking Union Medical College/Peking University First Hospital(China)
• [Int'l Joint Research] McGill University Health Centre(Canada)
• [Int'l Joint Research] Hadassah-Hebrew Univ. Medical Center(Israel)
• [Journal Article] Cell endogenous activities of fukutin and FKRP coexist with the ribitol xylosyltransferase, TMEM5 (2018)
  • Author(s): Nishihara, R., Kobayashi, K., Imae, R., Tsumoto, H., Manya, H., Mizuno, M., Kanagawa, M., Endo, T., and Toda, T.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 497 Pages: 1025-1030
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.02.162
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Experimental phase determination with selenomethionine or mercury-derivatization in serial femtosecond crystallography (2017)
  • Author(s): Yamashita, K., et al.
  • Journal Title: IUCr J. Volume: 4 Pages: 639-647
  • DOI: 10.1107/s2052252517008557
  • NAID: 120006335658
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Glycosylation with ribitol-phosphate in mammals: New insights into the O -mannosyl glycan (2017)
  • Author(s): Manya, H., and Endo, T.
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects Volume: 1861 Pages: 2462-2472
  • DOI: 10.1016/j.bbagen.2017.06.024
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 3D structural analysis of proteinO-mannosyl kinase, POMK, a causative gene product of dystroglycanopathy (2017)
  • Author(s): Nagae M, Mishra SK, Neyazaki M, Oi R, Ikeda A, Matsugaki N, Akashi S, Manya H, Mizuno M, Yagi H, Kato K, Senda T, Endo T, Nogi T, Yamaguchi Y
  • Journal Title: Genes Cells Volume: 22 Pages: 348-359
  • DOI: 10.1111/gtc.12480
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The Muscular Dystrophy GeneTMEM5Encodes a Ribitol β1,4-Xylosyltransferase Required for the Functional Glycosylation of Dystroglycan (2016)
  • Author(s): Manya, H., Yamaguchi, Y., Kanagawa, M., Kobayashi, K., Tajiri, M., Akasaka-Manya, K., Kawakami, H., Mizuno, M., Wada, Y., Toda, T., and Endo, T.
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 291 Pages: 24618-24627
  • DOI: 10.1074/jbc.m116.751917
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Carbohydrate-binding domain of the POMGnT1 stem region modulatesO-mannosylation sites of α-dystroglycan (2016)
  • Author(s): Kuwabara N, Manya H, Yamada T, Tateno H, Kanagawa M, Kobayashi K, Akasaka-Manya K, Hirose Y, Mizuno M, Ikeguchi M, Toda T, Hirabayashi J, Senda T, Endo T, Kato R.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Volume: 113 Pages: 9280-9285
  • DOI: 10.1073/pnas.1525545113
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Analysis of phenotype, enzyme activity and genotype of Chinese patients with POMT1 mutation (2016)
  • Author(s): Haipo Yang, Hiroshi Manya, Kazuhiro Kobayashi, HUI JIAO, Xiaona Fu, Jiangxi Xiao, Xiaoqing Li, Jingmin wang, Yuwu Jiang, TATSUSHI TODA, Tamao Endo, Xiru Wu,Hui Xiong,
  • Journal Title: Journal of Human Genetics Volume: 印刷中 Pages: 753-759
  • DOI: 10.1038/jhg.2016.42
  • NAID: 40020923851
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Mutations in POMGNT1 cause non-syndromic retinitis pigmentosa (2016)
  • Author(s): Mingchu Xu, Takeyuki Yamada, Zixi Sun, Aiden Eblimit, Irma Lopez, Feng Wang, Hiroshi Manya, Shan Xu, Li Zhao, Yumei Li, Adva Kimchi, Dror Sharon, Ruifang Sui, Tamao Endo, Robert K. Koenekoop, Rui Chen
  • Journal Title: Hum. Molec. Genet. Volume: 25 Pages: 1479-1488
  • DOI: 10.1093/hmg/ddw022
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 筋ジストロフィー症原因遺伝子TMEM5はジストログリカンの機能糖鎖修飾に必要なβ1,4-xylosyltransferaseをコードする (2017)
  • Author(s): 萬谷博、山口芳樹、金川基、小林千浩、田尻道子、赤阪-萬谷啓子、川上宏子、水野真盛、和田芳直、戸田達史、遠藤玉夫
  • Organizer: 日本薬学会第137年会.
  • Place of Presentation: 宮城県仙台市（仙台国際センター）
  • Year and Date: 2017-03-24
  • Invited
• [Presentation] Regulatory mechanism in post-phosphoryl modification of the O-mannosyl glycan. (2017)
  • Author(s): Tamao Endo
  • Organizer: 5th International Workshop for Glycosylation Defects in Muscular Dystrophies.
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] ジストログリカノパチー原因遺伝子産物Protein O-Mannosyl Kinase (POMK)の構造生物学的研究 (2017)
  • Author(s): 長江雅倫、Sushil K. Mishra、根谷崎牧子、大井里香、池田明美、松垣直宏、明石知子、萬谷博、水野真盛、矢木宏和、加藤晃一、千田俊哉、遠藤玉夫、禾晃和、山口芳樹
  • Organizer: 第36回日本糖質学会年会
• [Presentation] 筋ジストロフィー症原因遺伝子産物TMEM5によるジストログリカンの機能糖鎖修飾 (2017)
  • Author(s): 萬谷博、山口芳樹、 金川基、小林千浩、田尻道子、赤阪-萬谷啓子、川上宏子、水野真盛、和田芳直、戸田達史、遠藤玉夫
  • Organizer: 第36回日本糖質学会年会
• [Presentation] Fukutin-related protein (FKRP)の結晶構造と基質認識機構解析 (2017)
  • Author(s): 桑原直之、萬谷博、金川基、今江理恵子、田中智博、小林千浩、戸田達史、水野真盛、遠藤玉夫、加藤龍一
  • Organizer: 第36回日本糖質学会年会
• [Presentation] α-ジストログリカノパチー原因遺伝子産物TMEM5によるジストログリカン糖鎖の修飾 (2017)
  • Author(s): 萬谷博、山口芳樹、金川基、小林千浩、田尻道子、赤阪-萬谷啓子、川上宏子、水野真盛、和田芳直、戸田達史、遠藤玉夫
  • Organizer: 第3回日本筋学会学術集会
• [Presentation] タンパク質の翻訳後修飾、糖鎖、その生合成と遺伝性筋疾患 (2017)
  • Author(s): 遠藤玉夫
  • Organizer: 第3回日本筋学会学術集会
• [Presentation] Glycosylation with ribitol-phosphate (2017)
  • Author(s): Tamao Endo
  • Organizer: 24th International Symposium on Glycoconjugates
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Carbohydrate-binding domain of the POMGnT1 stem region modulates O-mannosylation sites of α-dystroglycan (2017)
  • Author(s): Naoyuki Kuwabara, Hiroshi Manya, Takeyuki Yamada, Hiroaki Tateno, Motoi Kanagawa, Kazuhiro Kobayashi, Keiko Akasaka-Manya, Yuriko Hirose, Mamoru Mizuno, Mitsunori Ikeguchi, Tatsushi Toda, Jun Hirabayashi, Toshiya Senda, Tamao Endo, Ryuichi Kato
  • Organizer: 24th International Symposium on Glycoconjugates
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] タンパク質の翻訳後修飾、糖鎖、その異常による先天性筋ジストロフィー (2017)
  • Author(s): 遠藤玉夫
  • Organizer: 都産技研医療機器産業参入支援事業キックオフ記念セミナー
  • Invited
• [Presentation] Systematic Clinical, Biochemical, and Molecular Elucidation of Genetic Disorders due to Defective Synthesis of O-Mannose Type Sugar Chains, including Fukuyama-type Muscular Dystrophy, and Discovery of Sugar Chains of Novel Structures (2017)
  • Author(s): Tatsushi Toda and Tamao Endo
  • Organizer: 水谷糖質科学振興財団設立25周年記念講演会
  • Invited
• [Presentation] 糖鎖研究から見た筋ジストロフィー (2017)
  • Author(s): 遠藤玉夫
  • Organizer: 国立精神・神経医療研究センター 国際セミナー
  • Invited
• [Presentation] POMGnT1の構造解析による筋ジストロフィー疾患発症機序解明 (2017)
  • Author(s): 桑原直之、萬谷 博、山田健之、舘野浩章、金川 基、小林千浩、赤阪敬子、広瀬友理子、水野真盛、池口満徳、戸田達史、平林 淳、千田俊哉、遠藤玉夫、加藤龍一
  • Organizer: 第40回日本分子生物学会年会第90回日本生化学会大会（2017年度生命科学系学会合同年次大会（ConBio2017）
• [Presentation] 新しい糖鎖、その生合成異常による先天性筋ジストロフィーの発症 (2017)
  • Author(s): 遠藤玉夫
  • Organizer: 理研シンポジウム 細胞内糖修飾の統合的ケミカルバイオロジー
• [Presentation] 哺乳類細胞発現系によるFukutin-related protein (FKRP)の大量精製と結晶構造決定 (2017)
  • Author(s): 桑原直之、萬谷博、今江理恵子、遠藤玉夫、千田俊哉、加藤龍一
  • Organizer: 2017年度量子ビームサイエンスフェスタ
• [Presentation] 筋ジストロフィー症原因遺伝子産物フクチンはジストログリカン糖鎖にグリセロールリン酸を導入する活性を有する (2017)
  • Author(s): 今江 理恵子、萬谷 博、田中 智博、水野 真盛、金川 基、小林 千浩、戸田 達史、遠藤 玉夫
  • Organizer: 日本薬学会第138年会
• [Presentation] 新型の翻訳後修飾体「リビトールリン酸」の同定～修飾機序と筋ジストロフィー病態への関与～ (2016)
  • Author(s): 金川基、小林千浩、田尻道子、萬谷博、久我敦、山口芳樹、和田芳直、遠藤玉夫、戸田達史
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神奈川県横浜市（パシフィコ横浜）
  • Year and Date: 2016-11-30
  • Invited
• [Presentation] 糖転移酵素POMGnT1の機能同定と糖鎖認識機構解析 (2016)
  • Author(s): 桑原直之, 萬谷博, 山田健之, 舘野浩章, 金川基, 小林千浩, 萬谷-赤阪啓子, 弘瀬友理子, 水野真盛, 池口満徳, 戸田達史, 平林淳, 千田俊哉, 遠藤玉夫, 加藤龍一
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神奈川県横浜市（パシフィコ横浜）
  • Year and Date: 2016-11-30
• [Presentation] αジストログリカン糖鎖のリビトールリン酸タンデム構造とその生合成機構 (2016)
  • Author(s): 小林千浩, 金川基, 田尻道子, 萬谷博, 久我敦, 山口芳樹, 萬谷-赤坂啓子, 古川潤一, 水野真盛, 川上宏子, 篠原康郎, 和田芳直, 遠藤玉夫, 戸田達史
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神奈川県横浜市（パシフィコ横浜）
  • Year and Date: 2016-11-30
• [Presentation] O-マンノース型糖鎖の生合成と先天性筋ジストロフィー症 (2016)
  • Author(s): 萬谷博、赤阪-萬谷啓子、遠藤玉夫
  • Organizer: 首都大バイオコンファレンス2016
  • Place of Presentation: 東京都八王子市（首都大学東京）
  • Year and Date: 2016-11-18
• [Presentation] O-マンノース型糖鎖上に形成されるリビトールリン酸のタンデム構造とその生合成機構 (2016)
  • Author(s): 萬谷博、金川基、小林千浩、田尻道子、久我敦、山口芳樹、赤阪-萬谷啓子、古川潤一、水野真盛、川上宏子、篠原康郎、和田芳直、戸田達史、遠藤玉夫
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 宮城県仙台市（仙台国際センター）
  • Year and Date: 2016-09-25
• [Presentation] 糖転移酵素POMGnT1の糖鎖認識機構解析 (2016)
  • Author(s): 桑原直之、萬谷博、山田健之、舘野浩章、金川基、小林千浩、赤阪-萬谷啓子、弘瀬友理子、水野真盛、池口満徳、戸田達史、平林淳、千田俊哉、遠藤玉夫、加藤龍一
  • Organizer: 第34回日本糖質学会年会
  • Place of Presentation: 高知県高知市（高知市文化プラザ かるぽーと）
  • Year and Date: 2016-09-01
• [Presentation] リビトールリン酸を含むO-マンノース型糖鎖の新奇構造と生合成機構. (2016)
  • Author(s): 萬谷博、金川基、小林千浩、田尻道子、久我敦、山口芳樹、赤阪-萬谷啓子、古川潤一、水野真盛、川上宏子、篠原康郎、和田芳直、戸田達史、遠藤玉夫
  • Organizer: 第34回日本糖質学会年会
  • Place of Presentation: 高知県高知市（高知市文化プラザ かるぽーと）
  • Year and Date: 2016-09-01
• [Presentation] αジストログリカン糖鎖のリビトールリン酸タンデム構造とその生合成経路 (2016)
  • Author(s): 小林千浩、金川基、田尻道子、萬谷博、久我敦、山口芳樹、赤阪-萬谷啓子、古川潤一、水野真盛、川上宏子、篠原康郎、和田芳直、遠藤玉夫、戸田達史
  • Organizer: 第2回日本筋学会
  • Place of Presentation: 東京都小平市（国立精神・神経医療研究センター）
  • Year and Date: 2016-08-05
• [Presentation] α－ジストログリカノパチー原因遺伝子POMGNT1の変異による網膜色素変性症 (2016)
  • Author(s): 萬谷博、山田健之、遠藤玉夫
  • Organizer: 第2回日本筋学会
  • Place of Presentation: 東京都小平市（国立精神・神経医療研究センター）
  • Year and Date: 2016-08-05
• [Presentation] A novel carbohydrate binding domain of the POMGnT1 stem region modulates Omannosylation sites of α-dystroglycan (2016)
  • Author(s): N Kuwabara, H Manya, T Yamada, H Tateno, Y Hirose, M Mizuno, M Ikeguchi, J Hirabayashi, T Senda, T Endo and R Kato
  • Organizer: 10th International GLYCO T 2016 Conference
  • Place of Presentation: Toronto, Canada
  • Year and Date: 2016-07-19
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Processing of O-mannosyl glycan and its regulatory mechanism (2016)
  • Author(s): Tamao Endo
  • Organizer: 10th International GLYCO T 2016 Conference
  • Place of Presentation: Toronto, Canada
  • Year and Date: 2016-07-19
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 糖転移酵素 POMGnT1 のステムドメインは糖鎖を認識し、O-Man 型修飾部位の制御を行う (2016)
  • Author(s): 桑原直之、萬谷博、山田健之、舘野浩章、弘瀬友理子、水野真盛、池口満徳、平林淳、千田俊哉、遠藤玉夫、加藤龍一
  • Organizer: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 福岡県福岡市（福岡国際会議場）
  • Year and Date: 2016-06-07
• [Presentation] POMGNT1の変異が網膜色素変性症を引き起こす (2016)
  • Author(s): 山田健之、Mingchu Xu、萬谷博、Rui Chen、遠藤玉夫
  • Organizer: 第39回日本基礎老化学会大会
  • Place of Presentation: 神奈川県伊勢原市（伊勢原市民文化会館）
  • Year and Date: 2016-05-27
• [Presentation] 糖鎖合成機構とその破綻による先天性筋ジストロフィー (2016)
  • Author(s): 遠藤玉夫
  • Organizer: 第63回 日本生化学会 近畿支部例会
  • Place of Presentation: 兵庫県神戸市（神戸薬科大学）
  • Year and Date: 2016-05-21
  • Invited
• [Presentation] 新規糖鎖ユニット“リビトールリン酸”の同定と筋ジストロフィーへの関与 (2016)
  • Author(s): 金川基、小林千浩、田尻道子、萬谷博、久我敦、山口芳樹、和田芳直、遠藤玉夫、戸田達史
  • Organizer: 第63回 日本生化学会 近畿支部例会
  • Place of Presentation: 兵庫県神戸市（神戸薬科大学）
  • Year and Date: 2016-05-21
• [Presentation] リビトールリン酸による糖鎖修飾の発見と筋ジストロフィーにおける欠損 (2016)
  • Author(s): 久我敦、金川基、小林千浩、田尻道子、萬谷博、山口芳樹、赤阪-萬谷啓子、古川潤一、水野真盛、川上宏子、篠原康郎、和田芳直、遠藤玉夫、戸田達史
  • Organizer: 第57回日本神経学会学術大会
  • Place of Presentation: 兵庫県神戸市（神戸コンベンションセンター）
  • Year and Date: 2016-05-18
• [Presentation] 質量分析が明らかにしたリビトールリン酸を含むα-ジストログリカンの糖鎖構造 (2016)
  • Author(s): 田尻道子、金川基、小林千浩、萬谷博、久我敦、山口芳樹、赤阪-萬谷啓子、古川潤一、水野真盛、川上宏子、篠原康郎、遠藤玉夫、戸田達史、和田芳直
  • Organizer: 第64回質量分析総合討論会
  • Place of Presentation: 大阪府吹田市（ホテル阪急エキスポパーク）
  • Year and Date: 2016-05-18