Development of alternative oxidase inhibitors for the treatment of African trypanosomiasis

• Project/Area Number: 17F17420
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 外国
• Research Field: Parasitology (including sanitary zoology)
• Research Institution: Kyoto Institute of Technology
• Principal Investigator: 志波 智生 京都工芸繊維大学, 応用生物学系, 教授 (80401206)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): EBILOMA GODWIN 京都工芸繊維大学, 応用生物学系, 外国人特別研究員
• Project Period (FY): 2017-11-10 – 2019-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000); Fiscal Year 2018: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2017: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: トリパノソーマ / シアン耐性酸化酵素 / Ｘ線結晶構造解析 / 薬剤開発 / アスコフラノン / アフリカ睡眠病

Outline of Annual Research Achievements

(1) TAOの大腸菌による大量発現系の構築と精製法の確立
シアン耐性酸化酵素(TAO)の大腸菌での発現・精製を行い、活性のある純度の高い酵素サンプルの調整をActa Cryst. Sect. F 66, 275-278の方法の方法に基づき数回サンプルの調整を行った。得られたサンプルは、TAOの阻害活性の実験や結晶化に用いた。ミトコンドリア移行シグナルを欠いたTAOのコンストラクトを作成して、大腸菌での発現・精製を行った。得られたサンプルは、以前のサンプルとほぼ同様の酵素活性を示した。このサンプルを用いて、酵素阻害の実験や結晶化の実験を行なった。
(2) 精製したTAOを用いて、ミトコンドリア標的新油性カチオン(LP)骨格を有する阻害剤との阻害実験
新たに合成された阻害剤を用いて、彼自身が精製したTAOを用いて、TAOに対する阻害実験をおこない学術論文にまとめた。この論文には、EBILOMA Godwin Unekwuojo博士以外に、本学の大学院生及び学部学生と一緒に行った実験である。
(3) TAOとミトコンドリア標的新油性カチオン(LP)骨格を有する阻害剤との複合体のX線結晶構造解析
(1)で得られたサンプルを用いて、TAOのligand-free型の結晶を作成して阻害剤をsoakingで結晶中に浸み込ませて複合体の結晶を作成した。調整された複合体の結晶は大型放射光実験施設のSPring-8でX線回折強度データを収集して、構造解析を行った。分解能が3.0Åで解析した構造からは、活性部位とは離れた部位に化合物らしき電子密度が確認できたが、精度を高めるために更なる分解能の向上が必要である。得られた結果では、活性部位近傍の基質である酸素分子の通り穴が阻害剤との複合体では閉じており、このことで酸素が活性部位に到達できなくて酵素活性が阻害されたと考えられる。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Insights into the ubiquinol/dioxygen binding and proton relay pathways of the alternative oxidase (2019)
  • Author(s): Shiba Tomoo、Inaoka Daniel Ken、Takahashi Gen、Tsuge Chiaki、Kido Yasutoshi、Young Luke、Ueda Satoshi、Balogun Emmanuel Oluwadare、Nara Takeshi、Honma Teruki、Tanaka Akiko、Inoue Masayuki、Saimoto Hiroyuki、Harada Shigeharu、Moore Anthony L.、Kita Kiyoshi
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics Volume: 1860 Issue: 5 Pages: 375-382
  • DOI: 10.1016/j.bbabio.2019.03.008
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] SAR of 4-Alkoxybenzoic Acid Inhibitors of the Trypanosome Alternative Oxidase (2018)
  • Author(s): Meco-Navas A, Ebiloma GU, Martin-Dominguez A, Martinez-Benayas I, Cueto-Diaz EJ, Alhejely AS, Balogun EO, Saito M, Matsui M, Arai N, Shiba T, Harada S, de Koning HP, Dardonville C.
  • Journal Title: ACS Med. Chem. Lett. Volume: 9 Issue: 9 Pages: 293-298
  • DOI: 10.1021/acsmedchemlett.8b00282
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Selective Cytotoxicity of Dihydroorotate Dehydrogenase Inhibitors to Human Cancer Cells Under Hypoxia and Nutrient-Deprived Conditions (2018)
  • Author(s): Miyazaki Yukiko、Inaoka Daniel K.、Shiba Tomoo、Saimoto Hiroyuki、Sakura Takaya、Amalia Eri、Kido Yasutoshi、Sakai Chika、Nakamura Mari、Moore Anthony L.、Harada Shigeharu、Kita Kiyoshi
  • Journal Title: Frontiers in Pharmacology Volume: 9 Pages: 997-997
  • DOI: 10.3389/fphar.2018.00997
  • NAID: 120006987943
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] NovelCharacteristics of Mitochondrial Electron Transport Chain from Eimeria tenella (2018)
  • Author(s): Matsubayashi M, Inaoka DK, Komatsuya K, Hatta T, Kawahara F, Sakamoto K,Hikosaka K, Yamagishi J, Sasai K, Shiba T, Harada S, Tsuji N, Kita K.
  • Journal Title: Genes (Basel) Volume: 10 Issue: 1 Pages: 1-1
  • DOI: 10.3390/genes10010029
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Inhibition of trypanosome alternative oxidase without its N-terminal mitochondrial targeting signal (ΔMTS-TAO) by cationic and non-cationic 4-hydroxybenzoate and 4-alkoxybenzaldehyde derivatives active against T. brucei and T. congolense (2018)
  • Author(s): Ebiloma Godwin U., Ayuga Teresa Diaz, Balogun Emmanuel O., Gil Lucia Abad, Donachie Anne, Kaiser Marcel, Herraiz Tomas, Inaoka Daniel K., Shiba Tomoo, Harada Shigeharu, Kita Kiyoshi, de Koning Harry P., Dardonville Christophe
  • Journal Title: European Journal of Medicinal Chemistry Volume: 150 Pages: 385-402
  • DOI: 10.1016/j.ejmech.2018.02.075
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Biochemical studies of membrane bound Plasmodium falciparum mitochondrial L -malate:quinone oxidoreductase, a potential drug target (2018)
  • Author(s): Hartuti, E. D.; Inaoka, D. K.; Komatsuya, K.; Miyazaki, Y.; Miller, R. J.; Wang, X.; Sadikin, M.; Prabandari, E. E.; Waluyo, D.; Kuroda, M.; Amalia, E.; Matsuo, Y.; Nugroho, N. B.; Saimoto, H.; Pramisandi, A.; Watanabe, Y.; Mori, M.; Shiomi, K.; Balogun, E. O.; Shiba, T.; Harada, S.; Nozaki, T.; Kita, K
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics Volume: 1859 Issue: 3 Pages: 191-200
  • DOI: 10.1016/j.bbabio.2017.12.004
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Ubiquinone binding site of yeast NADH dehydrogenase revealed by structures binding novel competitive- and mixed-type inhibitors (2018)
  • Author(s): Yamashita Tetsuo, Inaoka Daniel Ken, Shiba Tomoo, Oohashi Takumi, Iwata So, Yagi Takao, Kosaka Hiroaki, Miyoshi Hideto, Harada Shigeharu, Kita Kiyoshi, Hirano Katsuya
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 8 Issue: 1 Pages: 2427-2427
  • DOI: 10.1038/s41598-018-20775-6
  • NAID: 120006532084
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Mitochondrion targeting-lipocations significantly improve the trypanocidal activity of Trypanosome Alternative Oxidase inhibitors (2018)
  • Author(s): EBILOMA Godwin Unekwuojo
  • Organizer: Trypanosoma brucei metabolism meeting at Pasteur Institute Paris, 2018
  • Int'l Joint Research