| Project/Area Number |
17H00407
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
工学Ⅳ(材料・生物工学系)
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
水田 敏史 国立大学法人鳥取大学, 技術部, 技術職員
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| Project Period (FY) |
2017
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2017)
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| Budget Amount *help |
¥390,000 (Direct Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2017: ¥390,000 (Direct Cost: ¥390,000)
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| Keywords | タンパク質細胞内導入 / 膜透過ペプチド / 電気穿孔法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【研究目的】
タンパク質の構造・機能解析は、精製後に試験管内で解析を行う手法が広く用いられてきた。しかし、細胞内には様々な分子が高濃度に存在するため、細胞内、細胞外ではタンパク質の構造・機能が異なる可能性があり、細胞内環境下における解析が重要であると考えられる。本研究は、膜透過ペプチド、電気穿孔法(エレクトロポレーション)により、細胞内にタンパク質を多量に導入する条件の探索を目的とした。
【研究方法】
対象となる細胞は、神経変性疾患に関連するタンパク質の細胞への影響を調査するため、マウス神経芽細胞腫(Neuro 2a)を用いた。膜透過ペプチドによる導入は、タンパク質に膜透過ペプチド(TAT配列)を連結した複合体を作製し、タンパク質濃度、緩衝液組成の条件検討を行った。複合体の作製は、目的タンパク質を発現する遺伝子組み換え大腸菌を用いた。エレクトロポレーションによる導入は、細胞への負荷電圧、タンパク質濃度、緩衝液組成の条件検討を行った。それぞれの実験において、タンパク質の導入確認は共焦点レーザー顕微鏡を用いた。
【研究成果】
膜透過ペプチド、エレクトロポレーションともに細胞内導入を確認した。膜透過ペプチドによる導入では、膜透過タンパク質(GFP+TAT配列)を含むPBS Bufferを培養細胞に添加後、細胞内局在が確認された。エレクトロポレーションによる導入においては、細胞への負荷が大きいことが予測されたため、導入条件、回復培養の手法を検討する必要があると考えられた。
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