アポトーシス誘導によって間質細胞の除去が可能な破骨細胞共存培養系の開発

• Project/Area Number: 17H00678
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 歯学
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 立川 絵里 国立大学法人長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 技術職員
• Project Period (FY): 2017
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥550,000 (Direct Cost: ¥550,000); Fiscal Year 2017: ¥550,000 (Direct Cost: ¥550,000)
• Keywords: 破骨細胞誘導 / マクロファージ / γ線照射

Outline of Annual Research Achievements

【目的】
破骨細胞誘導因子RANKL及びマクロファージ増殖因子M-CSFをNIH3T3細胞に強制発現させた破骨細胞誘導細胞とマクロファージを共存培養させる、in vitroでの破骨細胞誘導の評価では、マクロファージにRANKL蛋白及びM-CSFを添加する破骨細胞培養系に比べて安定して多数の破骨細胞を簡便かつ非常に安価に誘導できる。しかし共存する間質細胞の混在が必ずあり、それらの遺伝子や蛋白も同時に解析されてしまうことから、破骨細胞の遺伝子発現や蛋白を解析する研究には向いていない。本研究では、この破骨細胞誘導細胞にあらかじめγ線を照射し、破骨細胞誘導のピークとなる培養6日目にアポトーシスによる細胞死を誘導し、除去する実験系を開発することを目的とする。
【方法】
γ線を照射したRANKL及びM-CSF発現NIH3T3細胞を培養し、照射条件毎の細胞増殖活性及びアポトーシスの誘導時期を明らかにした。
次に、γ線を照射したRANKL及びM-CSF発現NIH3T3細胞をマウス骨髄由来マクロファージと共存培養した。TRAP染色により、最も破骨細胞誘導効率が高い照射条件を見出した。破骨細胞誘導後に全てのNIH3T3を除去することが可能な最少照射条件を見出すために、定量的PCRにてRANKL及びM-CSFの発現の有無を確認した。
さらに、γ線照射細胞を凍結保管して実験に使用することが可能であれば便利であるため、凍結保管したγ線照射細胞を用いて同様の実験を行った。
【結果及び考察】
今回は40～140Gyのγ線照射条件で実験を行ったが、120Gy照射時に最も破骨細胞誘導効率が高かった。RANKL及びM-CSFの発現は、100～140Gyで優位な差は認められなかったので、120Gyを最適条件とした。凍結保管したγ線照射細胞では、破骨細胞誘導効率が落ちるため、通常の5倍量の細胞数が必要となる。