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Molecular Mechanism and Applications of Rare Earth Elements-Dependent Stimulation in Microbial Production of Stereo-Regular (Homochiral) Poly-gamma-Glutamate as Novel Extremolyte-Like Materials

Research Project

Project/Area Number 17H03796
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Allocation TypeSingle-year Grants
Section一般
Research Field Applied microbiology
Research InstitutionKochi University

Principal Investigator

芦内 誠  高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 教授 (20271091)

Project Period (FY) 2017-04-01 – 2021-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help
¥11,960,000 (Direct Cost: ¥9,200,000、Indirect Cost: ¥2,760,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
Fiscal Year 2019: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2018: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000)
Fiscal Year 2017: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Keywords超広域環境微生物 / 環境適応因子 / ポリγグルタミン酸 / レアメタル(レアアース)バイオロジー / バイオツール化
Outline of Annual Research Achievements

堆肥から深海底までの地球環境に高度の適応した土壌細菌“巨大菌”にレアアース(特にジスプロシウム)を与えつつ培養すると、優位に増殖速度が増加することに加え、ポリγグルタミン酸(PGA)と呼ばれる有用バイオポリマーの生細胞当たりの生産能まで増大するという画期的な応答現象を発見した。レアメタル(レアアース)は、いわゆる重金属であることから、生物応答に関しては毒性や代謝抑制ありきの解析に焦点が絞られる中、本件は生物と重金属の新たな接点に焦点を当てる千載一遇の機会と判断した。技術的な部分ではその分子レベルでのエビデンスを得るための方法論確立を急ぐ必要があった。まずPGA増産現象に着目し、巨大菌と(レアアース応答性に乏しい)納豆菌のPGA合成遺伝子オペロン、特に発現制御を担う非翻訳領域を計算化学分析(二次構造形成による自由エネルギー変動など)に供した。今回、GC含量や構造遺伝子群の配置構成など、一般的な比較遺伝生化学上の類似性を示すが故に見落とされてきた実像が浮き彫りになった。具体的には、巨大菌においてのみ、バシラス属細菌の(多様な外因性ストレスや環境因子への応答を指揮する)グローバルレギュレータの中でも最上位に位置するDegU認識部位が複数個所見つかった。詳細分析を続けた。結果、推定転写開始点の約200塩基対上流には金属応答性リボスイッチ様の特殊塩基配列が見つかった。興味深いことに、ここにはDegU認識部位と重複する領域も存在した。PGA合成の環境因子制御に迫る”ホットスポット”の同定等、画期的な発見に繋がる。事実、巨大菌は高C/N比の富栄養下で炭素ベースのバイオプラスチックポリマーを蓄積するが、低C/N比かつ高塩条件に曝すと、一転してPGAを作りはじめる。外部刺激に応じて環境適応因子の代謝経路を転換する等、超広域環境微生物が備えるべき高度な適応戦略に、初めて分子解析のメスが入った。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

PGA生産菌として最も有名な“納豆菌”にレアアース応答性が見つからないことが、当該研究の特殊性をさらに高めている。すなわち、もはや飼い慣らされた食品発酵微生物にとって環境の変化に対する鋭敏応答はそれほど必要ではないのであろう(育種という人為操作の中で脱落したと考えてもよい)。実際、納豆菌におけるPGAの生理学的意義は全く分かっていない(納豆PGAの場合、菌の生存戦略ではなく食品嗜好の観点から残されただけの存在)。このような状況はPGAを環境適応因子として捉えることを難しくしてきた。今回、超広域環境微生物“巨大菌”に焦点を当てたことがブレークスルーとなり、さらに分子レベルでのエビデンスの発見にも繋がった。実際、高次機能領域(推定レアアース結合ループやDegU認識配列等)を含む当該調節遺伝子部位(Cap_5’-UTR)とDegUの相互作用において、DegUだけでは不十分であることが課題になっていたところ、新たに計画した本年度の調査(ゲルシフトアッセイを含む)において、DegU~Pとジスプロシウム(Dy)の共存が必須であることが判明したのは画期的であった。しかもその効果はDy濃度依存的に発揮されることまで分かってきた。知る限りにおいて、前例のない生命現象の分子機構であったことから、学術的なインパクトの高い科学誌への投稿と産業利用を視野に入れた特許出願を計画している。情報公開までのタイムラグの時期にある一方、その微生物学に与える波及的効果や発展性は相当以上と見込まれることを鑑み、当該年度に関しては「おおむね順調に進展している」との評価に値する成果を得ることができたとの結論としたい。

Strategy for Future Research Activity

三年次の成果は“起承転結”でいうところの「転」にあたる。地球土壌環境中にごく微量ながら広く存在しているとされる希土類(レアアース)のメタル(レアアース)バイオロジーの発展と充実に繋がる極めて重要な発見に至り、ブレークスルーに足る局面にあるとの認識を得ている。本件のひとつの「結」と考える「産業応用を意識した新境界研究“レアアースバイオエンジニアリング”」の幕開けを意識した最終年度としたい。以下、推進する二つの中課題についての方針を示す。

①DegU~P安定化因子の同定と機能分析:当該状態の安定化に機能未知因子「YabJ」が関わっている可能性が高まっている。そこで、YabJの強制発現株や共発現株を作製した後、これらを応用してPGA増産研究に資するインビボ試験系の革新を目指す。また、これらの機能や発現量を減衰させる仕組みや変異株を組み合わせる試みもあわせて進める。いわゆる正負の方向性を意識した二重分析で「YabJ」の実像/機能を浮き彫りにすることで、当該増産機能の理解深化を図る。

②Cap_5’-UTR配列のレアアース認識能分析:全17種のランタノイドを対象とする予備試験から、上述の分子相互作用はDy特異的な現象である可能性が強く示唆された。そこで、他のランタノイドを共存させてもDy認識能に変化がないかどうか調べる。非常によく似た性質のランタノイドを分離するケモ技術を確立されるまでにほぼ一世紀を要したが、今もなお、特定のレアアースのみを迅速に検出同定するための技術や材料を生み出すまでには到っていない。そのため、ここで期待される成果を起点に、レアアースバイオテクノロジーに資する(これまでにないタイプの)DNA材料の設計合成が進展するものと期待される。

Report

(3 results)
  • 2019 Annual Research Report
  • 2018 Annual Research Report
  • 2017 Annual Research Report

Research Products

(67 results)

All 2020 2019 2018 2017 Other

All Journal Article (7 results) (of which Peer Reviewed: 5 results,  Open Access: 3 results) Presentation (55 results) (of which Int'l Joint Research: 5 results,  Invited: 9 results) Book (2 results) Remarks (1 results) Patent(Industrial Property Rights) (2 results)

  • [Journal Article] アーキアポリγグルタミン酸の新用途開発2019

    • Author(s)
      白米優一, 芦内 誠
    • Journal Title

      バイオインダストリー

      Volume: 36 Pages: 27-37

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      Ai Minobe, Kenji Fukui, Hitomi Yonezu, Koki Ohshita, Saki Mizobuchi, Takashi Morisawa, Yuichi Hakumai, Takato Yano, Makoto Ashiuchi, Taisuke Wakamatsu
    • Journal Title

      DNA repair

      Volume: 75 Pages: 29-38

    • DOI

      10.1016/j.dnarep.2019.01.005

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  • [Journal Article] Metal‐ion‐induced expression of gene fragments from subseafloor micro‐organisms in the Kumano forearc basin, Nankai Trough2018

    • Author(s)
      T. Wakamatsu Y. Morono T. Futagami T. Terada S. Nishikawa T. Morisawa K. Ohshita F. Inagaki M. Ashiuchi
    • Journal Title

      J. Appl. Microbiol.

      Volume: 125 Pages: 1396-1407

    • DOI

      10.1111/jam.14061

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    • Author(s)
      K. Fukui, A. Harada, T. Wakamatsu, A. Minobe, K. Ohshita, M. Ashiuchi, T. Yano
    • Journal Title

      FEBS Lett.

      Volume: 592 Pages: 4066-4077

    • DOI

      10.1002/1873-3468.13279

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  • [Journal Article] Microbial control using engineered poly-γ-glutamate-based materials2018

    • Author(s)
      M. Ashiuchi
    • Journal Title

      Jpn. J. Food Microbiol.

      Volume: 35(3) Pages: 116-121

    • NAID

      130007496274

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      Ashiuchi Makoto、Hakumai Yuichi、Nakayama Sawami、Higashiuchi Haruna、Shimada Kosuke
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 8 Pages: 1-9

    • DOI

      10.1038/s41598-018-23017-x

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  • [Journal Article] Archaeal MutS5 tightly binds to Holliday junction similarly to eukaryotic MutSγ2017

    • Author(s)
      Ohshita Koki、Fukui Kenji、Sato Mizuki、Morisawa Takashi、Hakumai Yuichi、Morono Yuki、Inagaki Fumio、Yano Takato、Ashiuchi Makoto、Wakamatsu Taisuke
    • Journal Title

      The FEBS Journal

      Volume: 284 Pages: 3470-3483

    • DOI

      10.1111/febs.14204

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      溝渕早紀, 若松泰介,寺田武志,芦内 誠,諸野祐樹
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      芦内 誠
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      A.Yoshida, T.Wakamatsu, T.Morisawa, T.Terada, S.Ishii, F.Inagaki, M.Ashiuchi, Y.Morono
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      ASME2019
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  • [Presentation] 巨大ウイルス由来R3Hドメイン含有 3'-5'エキソヌクレアーゼの生化学的機能解析2019

    • Author(s)
      美濃部亜衣, 大下紘貴, 福井健二, 武村政春, 矢野貴人, 芦内 誠, 若松泰介
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      白米優一, 山内七海, 芦内 誠
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      M.Ashiuchi, Y.Hakumai
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      日本生化学会・年次大会
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      芦内 誠, 白米優一
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  • [Presentation] 機能性ポリ-γ-グルタミン酸イオンコンプレックス2019

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      芦内 誠, 白米優一
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  • [Presentation] Transforming archaeal poly-γ-glutamate into functional plastics, including engineered antimicrobial coatings2019

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      M.Ashiuchi, Y.Hakumai
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      ICBP2019
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    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] シロイヌナズナ由来MSH1 C末端GIY-YIGヌクレアーゼドメインの機能解析2019

    • Author(s)
      美濃部亜衣, 大下紘貴, 福井健二, 原田明子, 矢野貴人, 芦内 誠, 若松泰介
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      日本農芸化学会中四国支部例会
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  • [Presentation] 巨大ウイルスが持つR3Hドメイン含有推定上エキソヌクレアーゼ MIMI_R431 の機能解析2019

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      大久保秀平, 大下紘貴, 福井健二, 矢野貴人, 芦内 誠, 若松泰介
    • Organizer
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  • [Presentation] 巨大ウイルス由来推定上DNAミスマッチ修復酵素MutS7の生化学的機能解析2019

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      大下紘貴, 美濃部亜衣, 福井健二, 矢野貴人, 芦内 誠, 若松泰介
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  • [Presentation] 海底下微生物遺伝子を対象とした基質誘導性遺伝子発現解析法(SIGEX)による基質応答解析2019

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      溝渕早紀, 若松泰介, 森澤高至, 西川奈七, 寺田武志, 稲垣史生, 芦内 誠, 諸野祐樹
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    • Organizer
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      芦内 誠
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      芦内 誠
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      白米優一, 中山沢水, 東内遥菜, 島田幸育, 芦内 誠
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      芦内 誠
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      白米優一, 中山沢水, 東内遥菜, 芦内 誠
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      白米優一, 芦内 誠
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      芦内 誠
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      日本農芸化学会中四国支部 第48回例会(受賞記念講演)
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      白米優一, 芦内 誠
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      芦内 誠
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      芦内 誠
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      大下紘貴, 福井健二, 佐藤瑞希, 森澤高至, 白米優一, 諸野祐樹, 稲垣史生, 矢野貴人, 芦内 誠, 若松泰介
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      日本農芸化学会中四国支部 第48回例会
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      生命科学系学会 合同年次大会
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      白米優一, 東内遥菜, 芦内 誠
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      JpGU-AGU Joint Meeting 2017
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      163
    • Publisher
      (有)中島出版
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    • Inventor(s)
      芦内 誠, 白米優一
    • Industrial Property Rights Holder
      高知大学
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Patent Publication Number
      2018-159064
    • Filing Date
      2018
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    • Inventor(s)
      芦内 誠, 白米優一, 大岩聖佳, 石原 悠
    • Industrial Property Rights Holder
      高知大学, 出光興産(株)
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      2019-060980
    • Filing Date
      2018
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Published: 2017-04-28   Modified: 2022-12-28  

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