O-マンノース型糖鎖の構造多様性とその決定機構の解明

• Project/Area Number: 17H03987
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: Biological pharmacy
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology
• Principal Investigator: 萬谷 博 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究副部長 (20321870)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥17,940,000 (Direct Cost: ¥13,800,000、Indirect Cost: ¥4,140,000); Fiscal Year 2021: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2020: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2019: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2018: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2017: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
• Keywords: 糖鎖 / 神経疾患 / 筋疾患 / O-マンノース型糖鎖

Outline of Annual Research Achievements

O-マンノース（Man）型糖鎖には多様な構造が存在し、構造の特徴によりコアM1、コアM2、コアM3の3タイプに分類される。コアM3の合成不全は中枢神経障害を伴う先天性筋ジストロフィー症の原因となる。我々は、コアM3にリビトールリン酸（RboP）が含まれることを発見し、コアM3の構造と生合成機構を解明してきた。本研究では、O-Man型糖鎖合成に関わる糖転移酵素群の機能を解析することで、多様な構造の存在意義や多様な構造をつくるメカニズムの解明を目指している。O-Man型糖鎖の生合成では、小胞体（ER）においてO-Man転移酵素POMT1-POMT2によりManが転移された後に、GlcNAc転移酵素POMGNT2によりGlcNAcβ1-4Manが形成されるとコアM3糖鎖となり、POMGNT2による修飾を受けなかった場合は、ゴルジ移行後に別のGlcNAc転移酵素POMGNT1によりGlcNAcβ1-2Manが形成されコアM1およびコアM2系の糖鎖となる。本年度はPOMGNT2のX線結晶構造を解析し、コアM3糖鎖の修飾部位を決定するメカニズムについて検討した。N末側の細胞質領域と膜貫通領域を除いた可溶型POMGNT2をHEK293細胞で発現、精製し、X線結晶構造解析に用いた。結晶構造からPOMGNT2はN末側の触媒領域とC末側のフィブロネクチンIII（FnIII）様領域からなり2量体を形成していた。基質との共結晶解析から、一方の分子の触媒領域でドナー基質のUDP-GlcNAcとアクセプター基質のマンノシルスレオニン（Man-Thr）とその前後数残基のアミノ酸を認識し、もう一方の分子のFnIII領域はアクセプター基質のC末側アミノ酸と相互作用していた。アクセプター基質の認識には、Man-Thrを含む約12残基のアミノ酸配列が最も重要であることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年までのPOMKとFKRPの結晶構造の解明に引き続き、今年度はPOMGNT2の結晶構造の解明に成功し、O-Man型糖鎖合成関連酵素のX線結晶構造解析は順調に進捗している。POMGNT2の基質認識に、Man-Thrを含む約12残基のアミノ酸配列が重要であることなど、コアM3糖鎖修飾部位の決定に関わる新たなメカニズムが明らかとなった。こうした結晶構造解析による基質認識機構の解明は、O-Man型糖鎖がどのような構造の糖鎖あるいはタンパク質の上に合成されるのかを調べる上で重要であり、また、変異による疾患発症のメカニズムを理解する上で重要である。

Strategy for Future Research Activity

2019年度に引き続き以下の計画を進め、最終年度として結果の取りまとめを行う。
（１）O-Man型糖鎖合成関連酵素の構造と機能の解析： X線構造解析により、各酵素の基質認識機構およびドメイン構造と各ドメインの機能を解析する。生化学的手法により構造解析から得られる情報と酵素活性などとの関連を解析し、疾患型変異による機能への影響や病態との関連を検討する。昨年度に引き続き引き続きFKTNとTMEM5の結晶化を進める。
（２）RboP糖鎖およびO-Man型糖鎖修飾タンパク質の探索：これまでに報告されたRboP含有糖鎖は、哺乳類ではα-ジストログリカンに修飾されたO-Man型糖鎖のみであり、他のタンパク質の修飾は不明である。そこで、リビトールリン酸糖鎖の他タンパク質における修飾を調べる。
（３）CDP-Rboトランスポーターの同定： O-Man型糖鎖の合成は小胞体およびゴルジ体内腔で行われるため、細胞質で合成された糖供与体はトランスポーターによりゴルジ内腔へ輸送される。RboPの供与体となるCDP-リビトールのトランスポーターは未だ同定されていないため、CDP-Rboトランスポーターの活性測定法を確立し同定を目指す。
（４）RboPおよびグリセロールリン酸（GroP）糖鎖の生合成経路と糖鎖機能の解析：哺乳類におけるリビトールリン酸およびCDP-Groの生合成経路の解明を目指す。また、コアM3糖鎖におけるGroP修飾の意義について調べる。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Radboud University Medical Center(オランダ)
• [Int'l Joint Research] Peking University First Hospital/Peking Union Medical College(中国)
• [Int'l Joint Research] Baylor College of Medicine(米国)
• [Int'l Joint Research] McGill University Health Centre(カナダ)
• [Int'l Joint Research] Radboud University Medical Center(オランダ)
• [Int'l Joint Research] Peking University First Hospital/Peking Union Medical College(中国)
• [Int'l Joint Research] Baylor College of Medicine(米国)
• [Int'l Joint Research] McGill University Health Centre(カナダ)
• [Int'l Joint Research] Radboud University Medical Center(オランダ)
• [Int'l Joint Research] Peking University First Hospital/Peking Union Medical College(中国)
• [Int'l Joint Research] Baylor College of Medicine(米国)
• [Int'l Joint Research] McGill University Health Centre(カナダ)
• [Int'l Joint Research] Radboud University Medical Center(オランダ)
• [Int'l Joint Research] Peking University First Hospital/Peking Union Medical College(中国)
• [Int'l Joint Research] Baylor College of Medicine(アメリカ合衆国)
• [Int'l Joint Research] McGill University Health Centre(カナダ)
• [Journal Article] FAM3B/PANDER-Like Carbohydrate-Binding Domain in a Glycosyltransferase, POMGNT1 (2020)
  • Author(s): Manya Hiroshi、Kuwabara Naoyuki、Kato Ryuichi、Endo Tamao
  • Journal Title: Methods in Molecular Biology Volume: 2132 Pages: 609-619
  • DOI: 10.1007/978-1-0716-0430-4_52
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Biosynthetic Mechanisms of a Unique Ribitol Phosphate-containing Glycan by FKRP, a Ribitol Phosphate Transferase (2020)
  • Author(s): Imae R, Kuwabara N, Manya H, Kato R, Endo T
  • Journal Title: TIGG Volume: 32 Issue: 190 Pages: E195-E200
  • DOI: 10.4052/tigg.2008.1e 10.4052/tigg.2008.1E
  • ISSN: 0915-7352, 1883-2113
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structures of fukutin-related protein (FKRP), a ribitol-phosphate transferase related to muscular dystrophy. (2020)
  • Author(s): Kuwabara N, Imae R, Manya H, Tanaka T, Mizuno M, Tsumoto H, Kanagawa M, Kobayashi K, Toda T, Senda T, Endo T, Kato R.
  • Journal Title: Nat Commun Volume: 11 Pages: 303-303
  • DOI: 10.1038/s41467-019-14220-z
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Mechanisms of <i>O</i>-Mannosyl Glycan Biosynthesis in Mammals (2019)
  • Author(s): Manya Hiroshi
  • Journal Title: TIGG Volume: 31 Issue: 181 Pages: SE63-SE64
  • DOI: 10.4052/tigg.1930.2se 10.4052/tigg.1930.2SE
  • NAID: 130007683661
  • ISSN: 0915-7352, 1883-2113
  • Open Access
• [Journal Article] CDP-glycerol inhibits the synthesis of the functionalO-mannosyl glycan of α-dystroglycan (2018)
  • Author(s): Imae Rieko、Manya Hiroshi、Tsumoto Hiroki、Osumi Kenji、Tanaka Tomohiro、Mizuno Mamoru、Kanagawa Motoi、Kobayashi Kazuhiro、Toda Tatsushi、Endo Tamao
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 293 Pages: 12186-12198
  • DOI: 10.1074/jbc.ra118.003197
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cell endogenous activities of fukutin and FKRP coexist with the ribitol xylosyltransferase, TMEM5. (2018)
  • Author(s): Nishihara, R., Kobayashi, K., Imae, R., Tsumoto, H., Manya, H., Mizuno, M., Kanagawa, M., Endo, T., and Toda, T.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume: 497 Pages: 1025-1030
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.02.162
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 3D structural analysis of protein O-mannosyl kinase, POMK, a causative gene product of dystroglycanopathy. (2017)
  • Author(s): Nagae M, Mishra SK, Neyazaki M, Oi R, Ikeda A, Matsugaki N, Akashi S, Manya H, Mizuno M, Yagi H, Kato K, Senda T, Endo T, Nogi T, Yamaguchi Y
  • Journal Title: Genes Cells Volume: 22 Pages: 348-359
  • DOI: 10.1111/gtc.12480
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Tatsushi Toda and Tamao Endo win 107th Japan Academy Prize (2017)
  • Author(s): Kanagawa Motoi、Manya Hiroshi
  • Journal Title: Glycobiology Volume: 27 Pages: 599-600
  • DOI: 10.1093/glycob/cwx040
  • Open Access
• [Journal Article] Experimental phase determination with selenomethionine or mercury-derivatization in serial femtosecond crystallography. (2017)
  • Author(s): Yamashita, K., et al.
  • Journal Title: IUCr J. Volume: 4 Pages: 639-647
  • DOI: 10.1107/s2052252517008557
  • NAID: 120006335658
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Glycosylation with ribitol-phosphate in mammals: New insights into the O -mannosyl glycan. (2017)
  • Author(s): Manya, H., and Endo, T.
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects Volume: 1861 Pages: 2462-2472
  • DOI: 10.1016/j.bbagen.2017.06.024
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mechanism for the Deficiency in Post-Phosphoryl Modification of α-Dystroglycan Observed in POMGnT1-Caused Muscular Dystrophy (2017)
  • Author(s): 桑原 直之, 加藤 龍一, 萬谷 博, 遠藤 玉夫
  • Journal Title: Journal of the Crystallographic Society of Japan Volume: 59 Issue: 2-3 Pages: 114-120
  • DOI: 10.5940/jcrsj.59.114
  • NAID: 130006767785
  • ISSN: 0369-4585, 1884-5576
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Identification of ribitol-phosphate in mammalian O-mannosyl glycan and its biosynthetic mechanisms (2017)
  • Author(s): 萬谷 博、遠藤 玉夫
  • Journal Title: 生化学 Volume: 89 Issue: 5 Pages: 605-612
  • DOI: 10.14952/SEIKAGAKU.2017.890605
  • ISSN: 0037-1017
• [Presentation] 筋ジストロフィー症原因遺伝子産物FKRPによるO-マンノース型糖鎖へのリビトールリン酸転移機構 (2021)
  • Author(s): 今江 理恵子、桑原 直之、萬谷 博、加藤 龍一、遠藤 玉夫
  • Organizer: 日本薬学会第141年会
• [Presentation] リビトールリン酸転移酵素FKRPによるO-マンノース型糖鎖伸長機構 (2020)
  • Author(s): 今江理恵子、桑原直之、萬谷博、加藤龍一、遠藤玉夫
  • Organizer: 第93回日本生化学会大会
• [Presentation] O-マンノース型糖鎖の伸長過程におけるFKRPによるリビトールリン酸転移機構 (2020)
  • Author(s): 今江理恵子、桑原直之、萬谷博、加藤龍一、遠藤玉夫
  • Organizer: 第39回日本糖質学会年会
• [Presentation] グリセロールリン酸供与体CDP-グリセロールの哺乳動物における定量分析 (2019)
  • Author(s): 今江理恵子、萬谷博、津元裕樹、石渡俊行、遠藤玉夫
  • Organizer: 第38回日本糖質学会年会
• [Presentation] 哺乳動物培養細胞および組織におけるCDP-グリセロールの定量分析 (2019)
  • Author(s): 今江理恵子、萬谷博、津元裕樹、石渡俊行、遠藤玉夫
  • Organizer: 第92回日本生化学会大会
• [Presentation] α-ジストログリカン糖鎖合成阻害因子CDP-グリセロールの定量分析 (2019)
  • Author(s): 今江理恵子, 萬谷博, 津元裕樹, 遠藤玉夫
  • Organizer: 日本薬学会第140年会
• [Presentation] 糖鎖を利用した先天性筋ジストロフィー症の治療法開発 (2018)
  • Author(s): 萬谷博、赤阪啓子、今江理恵子、遠藤玉夫
  • Organizer: TOBIRA 第7回研究交流フォーラム
• [Presentation] Substrates recognition and oligomerization mechanism of Fukutin-related protein (FKRP). (2018)
  • Author(s): Naoyuki Kuwabara, Hiroshi Manya, Rieko Imae, Tomohiro Tanaka, Motoi Kanagawa, Kazuhiro Kobayashi, Tatsushi Toda, Mamoru Mizuno, Toshiya Senda, Tamao Endo, Ryuichi Kato
  • Organizer: 11th International Symposium on Glycosyltransferases (GlycoT 2018)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 福山型筋ジストロフィー原因遺伝子産物fukutinのグリセロールリン酸転移活性. (2018)
  • Author(s): 萬谷博、今江理恵子、津元裕樹、田中智博、水野真盛、金川基、小林千浩、戸田達史、遠藤玉夫
  • Organizer: 第4回日本筋学会学術集会
• [Presentation] 新規糖鎖修飾体グリセロールリン酸によるα-ジストログリカンの機能糖鎖合成阻害. (2018)
  • Author(s): 今江理恵子、萬谷博、津元裕樹、田中智博、水野真盛、金川基、小林千浩、戸田達史、遠藤玉夫
  • Organizer: 第37回日本糖質学会年会
• [Presentation] CDP-glycerolはα-ジストログリカンの糖鎖伸長を阻害する. (2018)
  • Author(s): 今江理恵子、萬谷博、津元裕樹、田中智博、水野真盛、金川基、小林千浩、戸田達史、遠藤玉夫
  • Organizer: 第91回日本生化学会大会
• [Presentation] 糖鎖異常による先天性筋ジストロフィー症の病態解明と薬学的展. (2018)
  • Author(s): 萬谷博
  • Organizer: 第62回日本薬学会関東支部大会
  • Invited
• [Presentation] Inhibitory effect of CDP-glycerol on the synthesis of the O-mannosyl glycan of α-dystroglycan (2018)
  • Author(s): Rieko Imae, Hiroshi Manya, Hiroki Tsumoto, Tamao Endo
  • Organizer: 首都大学東京バイオコンファレンス2018
• [Presentation] Biosynthesis of O-mannosyl glycan in mammals. (2018)
  • Author(s): Hiroshi Manya
  • Organizer: 糖鎖創薬研究拠点キックオフシンポジウム
  • Invited
• [Presentation] CDP-グリセロール添加によるα-ジストログリカンの機能糖鎖伸長およびラミニン結合能への影響. (2018)
  • Author(s): 今江理恵子、萬谷博、津元裕樹、遠藤玉夫
  • Organizer: 日本薬学会第139年会
• [Presentation] 新規糖鎖修飾機構の理解に基づく筋ジストロフィー症の病態解明と創薬への応用 (2018)
  • Author(s): 萬谷博
  • Organizer: 日本薬学会第139年会
  • Invited
• [Presentation] 筋ジストロフィー症原因遺伝子産物TMEM5によるジストログリカンの機能糖鎖修飾 (2017)
  • Author(s): 萬谷博, 山口芳樹, 金川基, 小林千浩, 田尻道子, 赤阪-萬谷啓子, 川上宏子, 水野真盛, 和田芳直, 戸田達史
  • Organizer: 第36回日本糖質学会年会
• [Presentation] ジストログリカノパチー原因遺伝子産物Protein O-Mannosyl Kinase (POMK)の構造生物学的研究,ポスター (2017)
  • Author(s): 長江雅倫, Sushil K. Mishra, 根谷崎牧子, 大井里香, 池田明美, 松垣直宏, 明石知子, 萬谷博, 水野真盛, 矢木宏和, 加藤晃一, 千田俊哉, 遠藤玉夫, 禾晃和, 山口芳樹
  • Organizer: 第36回日本糖質学会年会
• [Presentation] Fukutin-related protein (FKRP)の結晶構造と基質認識機構解析 (2017)
  • Author(s): 桑原直之, 萬谷博, 金川基, 今江理恵子, 田中智博, 小林千浩, 戸田達史, 水野真盛, 遠藤玉夫, 加藤龍一
  • Organizer: 第36回日本糖質学会年会
• [Presentation] Carbohydrate-binding domain of the POMGnT1 stem region modulates O-mannosylation sites of α-dystroglycan (2017)
  • Author(s): Naoyuki Kuwabara, Hiroshi Manya, Takeyuki Yamada, Hiroaki Tateno, Motoi Kanagawa, Kazuhiro Kobayashi, Keiko Akasaka-Manya, Yuriko Hirose, Mamoru Mizuno, Mitsunori Ikeguchi, Tatsushi Toda, Jun Hirabayashi, Toshiya Senda, Tamao Endo, Ryuichi Kato
  • Organizer: 4th International Symposium on Glyconjugates (GlycoXXIV)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 新規O-マンノース型糖鎖の発見とその異常による先天性筋ジストロフィー症 (2017)
  • Author(s): 萬谷博
  • Organizer: 2017年度生命科学系学会合同年次大会（ConBio2017）
  • Invited
• [Presentation] POMGnT1の構造解析による筋ジストロフィー疾患発症機序解明 (2017)
  • Author(s): 桑原直之, 萬谷博, 山田健之, 舘野浩章, 金川基, 小林千浩, 赤阪-萬谷啓子, 弘瀬友理子, 水野真盛, 池口満徳, 戸田達史, 平林淳, 千田俊哉, 遠藤玉夫, 加藤龍一
  • Organizer: 2017年度生命科学系学会合同年次大会（ConBio2017）
• [Presentation] 哺乳類細胞発現系によるFukutin-related protein (FKRP)の大量精製と結晶構造決定 (2017)
  • Author(s): 桑原直之, 萬谷博, 今江理恵子, 遠藤玉夫, 千田俊哉, 加藤龍一
  • Organizer: 2017年度量子ビームサイエンスフェスタ
• [Presentation] 筋ジストロフィー症原因遺伝子産物フクチンはジストログリカン糖鎖にグリセロールリン酸を導入する活性を有する (2017)
  • Author(s): 今江理恵子, 萬谷博, 津元裕樹, 田中智博, 水野真盛, 金川基, 小林千浩, 戸田達史, 遠藤玉夫
  • Organizer: 日本薬学会第138年会
• [Remarks] 東京都健康長寿医療センター
  • URL: https://www.tmghig.jp/research/index.html
• [Remarks] 東京都健康長寿医療センター研究所
  • URL: http://www.tmghig.jp/research/index.html